胺脱氢酶及其编码核酸与应用

本发明涉及蛋白修饰，特别涉及一种胺脱氢酶。同时，本发明还涉及该胺脱氢酶的编码核酸，以及该胺脱氢酶的应用。

背景技术：

1、在众多的胺类中，手性伯胺是众多生物活性分子中非常重要的基序或构造块，在医药领域有着广泛的应用，其合成方法主要有化学法和生物法。前者依赖重金属而后者转化率有待提高，后者经胺脱氢酶(amdh)能够以廉价的氨作为氨基供体，不对称还原胺化潜手性羟酮生成手性伯胺，理论转化率高，是理想的绿色合成途径。

2、胺脱氢酶，是指一类能催化物质(如糖类、有机酸、氨基酸)进行氧化还原反应的酶，在酶学分类中属于氧化还原酶类。反应中被氧化的底物称为氢供体或电子供体，被还原的底物称为氢受体或电子受体。当受体是氧气时，催化该反应的酶称为氧化酶，其他情况下都称为脱氢酶。不同的脱氢酶几乎都根据其底物的名称命名，胺脱氢酶是脱氢酶中的一种，据报道称，胺脱氢酶可以采用生物学方法制备手性胺，但目前报道的amdh种类极少且底物谱窄，严重限制了其工业应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提出一种胺脱氢酶，以使其可以催化以潜手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应而合成手性胺。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供了胺脱氢酶，对如seq id no.2所示的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，所述突变包含seq id no.2的第134、299、300位氨基酸中至少一个突变。

4、作为优选方案，所述突变包括下述(1)-(3)中的至少一种：

5、(1)第134位由v突变为a或g；

6、(2)第299位由v突变为a或g；

7、(3)第300位由s突变为g、a、v或f；

8、作为优选，所述突变为下述(m1)-(m8)中的任意一种：

9、(m1)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；

10、(m2)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为g；

11、(m3)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；且第299位氨基酸残基由v突变为a；

12、(m4)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；且第299位氨基酸残基由v突变为g；

13、(m5)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；且第299位氨基酸残基由v突变为a；且第300位氨基酸残基由s突变为g；

14、(m6)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；且第299位氨基酸残基由v突变为a；且第300位氨基酸残基由s突变为a；

15、(m7)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；且第299位氨基酸残基由v突变为a；且第300位氨基酸残基由s突变为v；

16、(m8)seq id no.2第134位氨基酸残基由v突变为a；且第299位氨基酸残基由v突变为a；且第300位氨基酸残基由s突变为f。

17、本发明的胺脱氢酶，其可应用在催化羟基酮和潜手性酮类化合物发生转氨反应制备手性胺的过程中。

18、本发明的第二方面，提供一种酶制剂，所述酶制剂包括上述的胺脱氢酶。

19、本发明的第三方面，提供编码上述的胺脱氢酶的核酸。

20、作为优选方案，所述核酸为对如seq id no.1所示的核苷酸序列进行下述(1)-(3)中的至少一种突变而获得：

21、(1)第401-402位核苷酸由tt突变为ca或gt；

22、(2)第896-897位核苷酸由tt突变为ca或gt；

23、(3)第898-900位核苷酸由agc突变为ggt或gca或gtt或ttt；

24、作为优选，所述突变为下述(1)-(8)中的任意一种：

25、(1)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；

26、(2)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为gt；

27、(3)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；且896-897位核苷酸由tt突变为ca；

28、(4)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；且896位核苷酸由t突变为g；

29、(5)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；且896-897位核苷酸由tt突变为ca；且898-900位核苷酸由agc突变为ggt；

30、(6)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；且896-897位核苷酸由tt突变为ca；且898-900位核苷酸由agc突变为gca；

31、(7)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；且896-897位核苷酸由tt突变为ca；且898-900位核苷酸由agc突变为gtt；

32、(8)seq id no.1第401-402位核苷酸由tt突变为ca；且896-897位核苷酸由tt突变为ca；且898-900位核苷酸由agc突变为ttt。

33、本发明的第四方面，提供一种包含上述核酸的表达载体。

34、优选地，所述表达载体为pet28a。

35、本发明的第五方面，提供一种包含上述核酸或表达载体的细胞。

36、优选地，所述的细胞为细菌(例如大肠杆菌)或真菌。

37、本发明的第六方面，提供一种上述胺脱氢酶的制备方法，所述制备方法包括将上述的表达载体导入细胞中，培养该细胞，获得所述胺脱氢酶。

38、优选地，所述细胞包括重组菌。

39、所述的制备方法还包括将上述核酸导入宿主菌中。

40、优选地，所述宿主菌包括大肠杆菌，具体可为大肠杆菌bl21(de3)。

41、优选地，所述的核酸通过上述的表达载体导入所述宿主菌。

42、本发明的胺脱氢酶的制备方法，通过蛋白质工程的手段可以将催化氨基酸底物的氨基酸脱氢酶改造为以酮、醛为底物的胺脱氢酶(amdh)。采用amdh催化以潜手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺的路线，具有绿色高效、成本低及产物光学纯度高的优点，是手性胺合成最理想的反应之一。

43、本发明的第七方面，提供上述的胺脱氢酶在制备式i所示的化合物中的应用；所述式i所示的化合物包括以式ii为底物在所述的胺脱氢酶催化下获得；

44、

45、其中，

46、r1代表芳基、杂芳基、烷基中的任意一种；

47、r2代表芳基、杂芳基、烷基中的任意一种；

48、r1与r2相同或不相同。

49、作为优选方案，所述芳基包括苯基或苄基，或烷基取代苯基或苄基，或卤素取代苯基或苄基，或硝基取代苯基或苄基，或烷基苯基，所述烷基苯基中烷基碳原子数为2-4；

50、所述杂芳基包括吡啶、嘧啶、噻唑、噻吩、呋喃、n-取代吲哚；

51、所述烷基的碳原子数为1-20。

52、本发明的胺脱氢酶，具有较高的还原胺化活性，其催化活性高，底物适应范围广，产率高且满足99％+立体选择性的要求，具有非常广阔的应用前景。