一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法

本发明涉及了细胞分化，具体涉及了一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法。

背景技术：

1、心脏传导系统(cardiac conduction system，ccs)的高度协调是引导哺乳动物心脏产生有序收缩的基础。哺乳动物成熟的ccs包含窦房结(sinoatrial node,san)、房室结(atrioventricularnode,avn)、房室束和心室传导网络。研究表明，san细胞具有最高的自动性，是心脏主要的起搏位点，为心脏每一次协调收缩提供主要的电刺激。san发育和功能紊乱导致病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,sss)。sss通常发生在老年人中，其患病率在我国持续上升。仅在美国每年就有超过35万例起搏器手术，其中因窦房结功能障碍而手术的患者占植入手术的一半以上。

2、目前对有症状的sss患者的治疗主要依靠植入式电子起搏器和对症治疗，缺乏针对病因的根本治疗。目前体外通过诱导多能干细胞已成功分化出具有窦房结样表型的起搏细胞。然而，目前大多数研究都是围绕心房、心室和窦房结样心肌细胞的混合群体进行的，且心肌细胞的体外诱导方案中的窦房结样细胞的分化比例极低，心肌细胞的混合亚型可能会改变疾病的表型，并影响移植细胞在体内的预后情况。目前缺乏针对窦房结样细胞的体外分化方法，研究出一种能提高窦房结样细胞单一亚群心肌细胞的体外分化比例的方法，具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、bmp信号选择性抑制剂和bmp信号激活剂同时在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。

4、研究发现，在hescs向心肌细胞定向分化过程中，单向抑制或激活bmp信号通路均能在体外促进窦房结样细胞的富集，但是通过针对性的研究发现，时序性、双向调控bmp信号通路显著促进了hescs向窦房结样细胞分化，能在体外高效获取具有窦房结电生理特性的起搏细胞。在分化早期选择性抑制bmp信号通路，接着激活bmp信号通路能显著增强诱导生成的细胞中窦房结基因的表达，极大地抑制了心房肌、心室肌的表达但同时也在一定程度上增加了房室结和非心肌细胞基因的表达。实验探究发现，双向调控bmp信号(bd)显著增强了诱导生成的细胞中窦房结基因的表达，同时极大地抑制了心房肌、心室肌的表达；双向调控bmp信号(bd)还显著增加了nkx2.5-/ctnt+细胞(窦房结样细胞)的生成比例；免疫荧光染色证明相比于giwi组，bd组显著上调了tbx3+/ctnt+、shox2+/ctnt+、tbx18+/ctnt+和nkx2.5-/ctnt+的比例。

5、进一步的，bmp信号选择性抑制剂为dmh1；和/或，bmp信号激活剂为bmp4重组蛋白。

6、进一步的，bmp信号选择性抑制剂的使用时间为诱导定向分化的第4-6天；bmp信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2-3μm，优选地，bmp信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2.5μm。

7、进一步的，bmp信号激活剂的使用时间为诱导定向分化的第7-9天；bmp信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.5-1ng/ml，优选地，bmp信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.625ng/ml。

8、本发明的另一目的是为了提供一种诱导分化培养基。

9、既往对窦房结样细胞的体外诱导方法的研究主要包括基因重编程诱导法、共培养诱导法和非基因修饰的信号通路诱导法。已有大量研究报道基因重编程诱导法可以实现干细胞甚至工作心肌细胞向窦房结样细胞的分化，并据此成功构建了具有起搏功能的生物起搏器；但是，通过基因重编程获得的窦房结样细胞的安全性却受到了极大质疑。另外，将干细胞与窦房结组织块或内胚层祖细胞共培养的条件诱导法虽然能成功诱导出具备电生理特性的窦房结样细胞，并在一定程度上避免了基因重编程带来的诸多弊端；但该方法在窦房结样细胞诱导稳定性和分化效率上的提升空间很小，很难实现在体外稳定、大量地获取高质量、高纯度的窦房结样细胞用于后续应用。

10、目前使用的单层贴壁心肌细胞分化方法是基于rpmi1640基础培养基混合“b27”添加剂的体系(“b27”添加剂是由21种成分组成的复杂混合物，包括许多动物来源的未知蛋白)，目前尚不清楚“b27”添加剂中的未知成分是否会影响窦房结样细胞在体外分化的效率、成熟度以及稳定性。

11、一种诱导分化培养基，诱导分化培养基包括分化完全培养基i、分化完全培养基ii、dmh1工作液、分化完全培养基iii和bmp4重组蛋白工作液；

12、其中，分化完全培养基i包括：rpmi 1640基础培养基,500μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa 2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白和5μm chir99021；

13、分化完全培养基ii包括：rpmi 1640基础培养基,500μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白和2μm wnt-c59；

14、分化完全培养基iii包括：rpmi 1640基础培养基,500μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa 2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白；

15、dmh1工作液为包括质量浓度为2.5μm dmh1的分化完全培养基iii；

16、bmp4重组蛋白工作液为包括质量浓度为0.625ng/ml bmp4重组蛋白的分化完全培养基iii。

17、本发明提供了一种诱导分化培养基，包括分化完全培养基i、分化完全培养基ii、dmh1工作液、分化完全培养基iii和bmp4重组蛋白工作液；基于化学成分明确的分化培养基(包含基础培养基rpmi1640、l-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白)在体外能够成功分化出高达95％的心肌细胞。该诱导分化培养基，成分明确，具有简便、高效、稳定、重复性高等优点，有效克服了体外诱导方法需要添加多种外源性未知蛋白，分化存在不稳定和效率低的缺点。本发明的又一目的是为了提供诱导分化培养基的应用。

18、本发明基于化学成分明确的分化培养基(包含基础培养基rpmi1640、l-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白)在体外能够成功分化出高达95％的心肌细胞。与拟胚体诱导体系和含“b27”添加剂的培养体系相比，该心肌细胞基础分化方案没有添加过多的细胞因子和未知动物源性蛋白，具有高效、稳定等优点，可作为在体外模拟心脏胚胎发育的理想模型。这为我们在体外开发针对窦房结样细胞的分化方法提供了基础。

19、上述的诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。

20、本发明的另一目的是为了提供一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法。

21、一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法，

22、步骤1、分化第0天，将胚胎干细胞加入分化完全培养基i，培养48h；

23、步骤2、分化第2天，切换成分化完全培养基ii，培养48h；

24、步骤3、分化第4-6天，将细胞加入2.5μm dmh1工作液进行培养；

25、步骤4、分化第6-7天，切换成分化完全培养基iii；

26、步骤5、分化第7-9天，将细胞加入0.625ng/ml bmp4重组蛋白工作液；

27、步骤6、第9天至21天，使用分化培养基iii继续培养，得到分化成的窦房结样细胞。

28、本发明提供的体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法，操作简单，分化效率高，便于推广应用。

29、进一步的，胚胎干细胞为人胚胎干细胞。

30、本发明的又一目的是为了提供对分化成的窦房结样细胞的纯化培养基。

31、心肌细胞和非心肌细胞(包括未分化的细胞)在葡萄糖和乳酸代谢方面存在显著的生化差异；以糖酵解为主要代谢方式的非心肌细胞无法在无糖的条件下存活，而心肌细胞则可以利用乳酸作为代谢底物来进行能量代谢。早期研究观察到孤立、原始窦房结细胞对长时间缺氧再通氧具有显着抵抗力和恢复力；tbx18诱导的起搏器样细胞(ipms)经过近似无氧状态和/或糖酵解抑制2天后几乎没有死亡，这些结果这表明起搏器样细胞具有低代谢需求以及能够耐受低氧应激和葡萄糖缺失的能力。这使得我们可以通过无糖培养基在体外进一步纯化诱导生成的窦房结样细胞。

32、一种对分化成的窦房结样细胞的纯化培养基，包括纯化完全培养基i和纯化完全培养基ii；

33、其中，纯化完全培养基i包括：不含d-葡萄糖的rpmi培养基，200μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白；

34、纯化完全培养基ii包括：不含d-葡萄糖的rpmi培养基，200μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白，2mm 2-deoxy-d-glucose和5mm dl-乳酸钠；

35、本发明提供一种对分化成的窦房结样细胞的纯化培养基，包括纯化完全培养基i和纯化完全培养基ii；研究发现，窦房结样细胞具有低代谢需求以及能够耐受低氧应激和葡萄糖缺失的能力，本发明提供的无糖培养基能够在体外进一步纯化诱导生成的窦房结样细胞，本发明利用流式细胞术检测了未纯化和纯化组的bd组在分化第25天细胞中窦房结样细胞(nkx2.5-ctnt+细胞)的生成比例。结果如图，对照组nkx2.5-ctnt+细胞比例为26.0±2％；纯化组nkx2.5-ctnt+细胞比例为35.0±3％。

36、利用上述的纯化培养基进行纯化培养的方法，包括以下步骤：

37、s1、取出分化成的窦房结样细胞，加入纯化完全培养基i，培养48h；

38、s2、48h后取出细胞，加入纯化完全培养基ii，继续培养2-4天。

39、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

40、1、本发明提出bmp信号选择性抑制剂和bmp信号激活剂同时在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。研究发现，在hescs向心肌细胞定向分化过程中，单向抑制或激活bmp信号通路均能在体外促进窦房结样细胞的富集，但是通过针对性的实验探究，发现时序性、双向调控bmp信号通路显著促进了hescs向窦房结样细胞分化，能在体外高效获取具有窦房结电生理特性的起搏细胞。通过dmh1先抑制bmp信号通路，从而抑制fhf祖细胞的生成或促进shf祖细胞的生成，在此基础上再次激活窦房结特异性信号通路实现窦房结样细胞的富集。在分化早期选择性抑制bmp信号通路，接着激活bmp信号通路能显著增强诱导生成的细胞中窦房结基因的表达，极大地抑制了心房肌、心室肌的表达但同时也在一定程度上增加了房室结和非心肌细胞基因的表达。实验探究发现，双向调控bmp信号(bd)显著增强了诱导生成的细胞中窦房结基因的表达，同时极大地抑制了心房肌、心室肌的表达；双向调控bmp信号(bd)还显著增加了nkx2.5-/ctnt+细胞(窦房结样细胞)的生成比例；免疫荧光染色证明相比于giwi组，bd组显著上调了tbx3+/ctnt+、shox2+/ctnt+、tbx18+/ctnt+和nkx2.5-/ctnt+的比例。

41、2、本发明提供的体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法，步骤1、分化第0天，将胚胎干细胞加入分化完全培养基i，培养48h；步骤2、分化第2天，切换成分化完全培养基ii，培养48h；步骤3、分化第4-6天，将细胞加入2.5μm dmh1工作液进行培养；步骤4、分化第6-7天，切换成分化完全培养基iii；步骤5、分化第7-9天，将细胞加入0.625ng/mlbmp4重组蛋白工作液；步骤6、第9天至21天，使用分化培养基iii继续培养，得到分化成的窦房结样细胞。操作简单，分化效率高，便于推广应用。

42、3、本发明提供了一种诱导分化培养基，包括分化完全培养基i、分化完全培养基ii、dmh1工作液、分化完全培养基iii和bmp4重组蛋白工作液；基于化学成分明确的分化培养基(包含基础培养基rpmi1640、l-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白)在体外能够成功分化出高达95％的心肌细胞。该诱导分化培养基，成分明确，具有简便、高效、稳定、重复性高等优点，有效克服了体外诱导方法需要添加多种外源性未知蛋白，分化存在不稳定和效率低的缺点。

43、4、本发明提供一种对分化成的窦房结样细胞的纯化培养基，包括纯化完全培养基i和纯化完全培养基ii；研究发现，窦房结样细胞具有低代谢需求以及能够耐受低氧应激和葡萄糖缺失的能力，本发明提供的无糖培养基能够在体外进一步纯化诱导生成的窦房结样细胞，本发明利用流式细胞术检测了未纯化和纯化组的bd组在分化第25天细胞中窦房结样细胞(nkx2.5-ctnt+细胞)的生成比例。对照组nkx2.5-ctnt+细胞比例为26.0±2％；纯化组nkx2.5-ctnt+细胞比例为35.0±3％。