一种酿酒酵母培养物及制备方法与流程

本发明涉及动物饲料添加剂生产，尤其涉及一种酿酒酵母培养物及制备方法。

背景技术：

1、仔猪在早期断奶时由于“消化道发育不完善”和环境、饲料等变化，易受应激影响，导致食欲不佳和肠道粘膜免疫屏障受损，常出现腹泻等问题，在限抗、禁抗的背景下，增强仔猪肠道健康和提高免疫调节能力是提高仔猪生长能力及降低仔猪死亡率的关键。

2、酵母菌，特别是酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），在动物饲料添加剂中得到了广泛应用，尤其是仔猪饲养中，酿酒酵母培养物具有富含丰富的蛋白质、氨基酸、b族维生素和功能性代谢产物，如β-葡聚糖和甘露寡糖，这些成分能够有效促进仔猪的生长、增强免疫力和改善消化功能，此外，酿酒酵母培养物还具有一定的抗氧化作用，有助于缓解仔猪在饲养过程中面临的环境应激。

3、然而，现有技术中为了增强发酵效果，通常采用多种微生物菌株的混合发酵方法，试图通过不同菌株的协同作用获得更高的产物质量和更广泛的功能性，这种多种微生物的发酵方式可以提供丰富的代谢产物和营养物质，改善饲料的消化利用率和营养含量，但在实际操作过程中却存在微生物之间相互干扰，各微生物发酵条件不同导致发酵效果不佳，并且多菌种发酵可能导致某些代谢产物的不稳定，或出现不良副产物积累，如部分微生物发酵过程中会产生大量的有机酸、乙醇或其他挥发性化合物，影响发酵物料的风味或功能性，甚至可能产生一些对仔猪健康有害的物质，这会直接影响发酵物料的适口性和营养价值，降低饲料添加剂的效果。

技术实现思路

1、为了解决上述技术缺陷，本发明研究出一种能够在避免多种微生物互相干扰的同时，具备优秀发酵效果的酿酒酵母培养物的制备方法，制备出的酿酒酵母培养物能够大幅提高仔猪的生长速度，同时大幅降低仔猪生长过程中的腹泻率和发病率。

2、一种酿酒酵母培养物的制备方法，包括以下步骤：

3、s1：昆布和锦葵叶的混合发酵

4、将昆布和锦葵叶干燥粉碎后浸泡在热水中，再进行高温灭菌得到无菌昆布溶液，在无菌昆布溶液中加入磷酸氢二钾、酵母提取物和葡萄糖混合均匀，调节ph后得到昆布培养基，将斜面保存的根霉菌菌株和米曲霉菌株分别进行活化扩培，得到根霉菌种子液和米曲霉种子液，将根霉菌种子液和米曲霉种子液混合后接种至昆布培养基中发酵，得到昆布发酵产物；

5、s2：高抗氧酵母的筛选

6、分别将白酒糟ⅰ、白酒糟ⅱ和白酒糟ⅲ进行梯度稀释，然后取各梯度酒糟样品进行划线培养，挑选具有酵母菌形态及菌落最大的菌株进行纯化培养，得到纯化酵母菌株ⅰ、纯化酵母菌株ⅱ和纯化酵母菌株ⅲ，将纯化酵母菌株ⅰ、纯化酵母菌株ⅱ和纯化酵母菌株ⅲ进行摇床培养，得到发酵菌液ⅰ、发酵菌液ⅱ和发酵菌液ⅲ，测定并计算各发酵菌液nadh含量与dcw含量的比值，然后选取比值最高的发酵菌液ⅰ作为酿酒酵母发酵菌液；

7、s3：发酵物料的制备与发酵

8、将麸皮、昆布发酵产物、漆酶、燕麦、糖蜜、乳清粉、硫酸铵和半胱氨酸以混合搅拌均匀后静置，再进行蒸汽灭菌，冷却后得到发酵物料，在发酵物料中加入酿酒酵母发酵菌液，调节水分含量后平铺于发酵床上进行发酵，得到固体发酵产物，再将固体发酵产物烘干粉碎，得到酿酒酵母培养物。

9、进一步地，步骤s1昆布和锦葵叶的混合发酵，包括以下步骤：

10、s1.1：将8-10重量份的昆布和4-6重量份的锦葵叶置于烘干箱中，以45-50℃的温度干燥至含水量为10-15%，然后研磨成粉末置于容器中，加入80-100重量份的55-60℃的热水，保持温度浸泡25-30分钟后以121-125℃的温度高温灭菌12-15分钟，冷却至室温后得到无菌昆布溶液，将无菌昆布溶液置于经过高温杀菌的容器中，加入0.1-0.2重量份的磷酸氢二钾、0.4-0.6重量份的酵母提取物和0.8-1重量份的葡萄糖，混合均匀并设置ph为5.5-6，得到昆布培养基；

11、s1.2：将斜面保存的根霉菌菌株和米曲霉菌株分别接种于pda固体培养基中，根霉菌菌株以28-30℃活化培养24-28小时，米曲霉菌株以28-30℃活化培养32-36小时，将活化后的根霉菌菌株和米曲霉菌株分别采用无菌水冲洗，并用无菌生理盐水稀释培养液中的孢子浓度至107-108cfu/ml，得到根霉菌孢子悬浮液和米曲霉孢子悬浮液，将根霉菌孢子悬浮液以2-5%的接种量接种至pdb培养基中，再在150-200rpm，28-30℃的条件下进行恒温摇床培养12-18小时，得到根霉菌种子液，将米曲霉孢子悬浮液以2-5%的接种量接种至pdb培养基中，再在150-200rpm、28-30℃的条件下进行恒温摇床培养18-24小时，得到米曲霉种子液；

12、s1.3：将根霉菌种子液和米曲霉种子液以1：（2-3）的体积比混合得到混合种子液，然后将混合种子液接种至昆布培养基中，接种量占昆布培养基质量的2-3wt％，在28-32℃下发酵40-48小时，得到昆布发酵产物。

13、进一步地，步骤s2高抗氧酵母的筛选，包括以下步骤：

14、s2.1：分别将等质量不同产地的白酒糟ⅰ、白酒糟ⅱ和白酒糟ⅲ置于容器中，加入9倍重量份的无菌水进行震荡稀释，得到第一梯度酒糟样品，再取1重量份的第一梯度酒糟样品加入9倍重量份的无菌水进行震荡稀释，得到第二梯度酒糟样品，重复上述步骤直至得到第五梯度酒糟样品，然后分别取各梯度酒糟样品100-200μl涂布于yped培养基中，每梯度酒糟样品设置3-4个平行组，均在28-30℃下培养2-3天，挑选具有酵母菌形态及菌落最大的菌株在yped培养基中进行划线培养，然后继续挑选菌落最大的菌株置于yped培养基中进行划线培养，重复挑选划线培养2-3次，直至挑选的单菌落在显微镜镜检下无其他杂菌，得到纯化酵母菌株ⅰ、纯化酵母菌株ⅱ和纯化酵母菌株ⅲ；

15、s2.2：分别将纯化酵母菌株ⅰ、纯化酵母菌株ⅱ和纯化酵母菌株ⅲ以3-5%的接种量接种至250-300ml装有液体培养基的摇瓶中，摇瓶中液体培养基的含量为100-150ml，液体培养基为未加入琼脂的yped培养基，然后在150-180rpm，28-30℃的条件下摇床培养36-40小时，得到发酵菌液ⅰ、发酵菌液ⅱ和发酵菌液ⅲ；

16、s2.3：分别取30-40ml发酵菌液ⅰ、发酵菌液ⅱ和发酵菌液ⅲ以8000-10000rpm的转速离心5-6分钟，抽滤去除上清液，然后用蒸馏水清洗后再次离心并抽滤去除上清液，65-70℃干燥至恒重，测定dcw，再分别取80-100μl去除的上清液，利用elisa试剂盒和酶标仪测定其吸光值，并根据nadh标准曲线换算得到酵母细胞中nadh的含量，计算nadh含量与dcw含量的比值，然后选取比值最高的发酵菌液ⅰ作为酿酒酵母发酵菌液。

17、进一步地，步骤s3发酵物料的制备与发酵，包括以下步骤：

18、s3.1：将麸皮、昆布发酵产物、漆酶、燕麦、糖蜜、乳清粉、硫酸铵和半胱氨酸以（60-70）：（10-15）：（0.02-0.03）：（2-5）：（1-1.5）：（0.1-0.3）：（0.1-0.15）：（0.01-0.02）的质量比混合，搅拌均匀后静置15-20分钟，然后置于蒸汽灭菌锅内，在105-110℃下灭菌15-20分钟，冷却后得到发酵物料；

19、s3.2：在发酵物料中加入5-8wt%的酿酒酵母发酵菌液，然后再加入无菌水调节水分含量为42-45%，平铺于发酵床上，控制厚度为18-20cm，然后以30-32℃的发酵温度发酵35-40小时，得到固体发酵产物，将固体发酵产物以45-50℃的温度烘干至水分含量为8-10%，然后进行粉碎，得到酿酒酵母培养物。

20、进一步地，步骤s1.2中的根霉菌菌株和米曲霉菌株均保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其中根霉菌菌株保藏编号为cicc40244，米曲霉菌株保藏编号为cicc40636。

21、进一步地，步骤s2.2中的液体培养基为未加入琼脂的yped培养基。

22、一种酿酒酵母培养物，其由上述一种酿酒酵母培养物的制备方法制备得到。

23、有益效果是：1、本发明通过将根霉菌和米曲霉进行混合，得到混合种子液，然后对由昆布和锦葵叶作为主要成分的昆布培养基进行发酵，得到昆布发酵产物后与麸皮、燕麦、糖蜜、乳清粉、硫酸铵和半胱氨酸混合灭菌制得发酵物料，然后再通过酿酒酵母进行发酵得到酿酒酵母培养物，区别于将根霉菌、米曲霉和酵母菌混合进行发酵的工艺，利用根霉菌和米曲霉对纤维素等酵母菌难以发酵分解的物质先进行分解，生成的多酚、维生素和海藻酸盐等低分子量物质，不仅能够增强酵母的抗氧化能力，促进酵母的代谢活性，提高其发酵效率和生物活性，而且避免了混合菌种的互相干扰，同时选择的昆布和锦葵叶发酵后还能为酿酒酵母培养物提供丰富的营养成分，如昆布中的氨基酸和碘、钙、镁等矿物质，能够为仔猪提供全面的营养支持，促进骨骼和肌肉的健康发育，提高其生长速度，锦葵叶中的纤维素和黏液质成分通过发酵后，形成具有润肠通便效果的物质，有助于防止仔猪便秘和其他肠道问题，促进饲料吸收，提高生长率，而且还能提供多酚、维生素c和硫代化合物，有助于减少仔猪体内的氧化应激，提升仔猪在面对环境应激（如断奶、转栏等）时的抗压能力，保证仔猪的健康生长。

24、本发明利用不同的白酒糟进行高抗氧酵母的筛选培养，先通过梯度培养筛选出菌落生长最好的菌落，然后对筛选的菌落进行多次纯化培养，得到纯化酵母菌株，避免杂菌污染，然后对纯化酵母菌株制得的发酵菌液进行dcw干重测试和nadh含量的测定，从而筛选出nadh含量与dcw含量比值最高的发酵菌液作为酿酒酵母发酵菌液，制备的酿酒酵母培养物中具有高含量的nadh以及能够高效率生成nadh的酵母菌，当仔猪摄入时能够直接或间接地参与对自由基的清除，防止自由基对细胞膜、蛋白质和dna的损伤，还可以帮助再生其他抗氧化剂，如维生素c和谷胱甘肽，进一步增强细胞的抗氧化防御，从而增强仔猪的免疫力，提升对细菌、病毒等病原体的抵抗能力，减少感染发病的概率，并且还可以增强仔猪体内的能量生产，提升细胞的代谢效率，为生长发育提供能量支持，提高仔猪生长率。

25、本发明通过将麸皮、昆布发酵产物、漆酶、燕麦、糖蜜、乳清粉、硫酸铵和半胱氨酸混合搅拌均匀后静置，此时漆酶能够对昆布发酵产物中多余的多酚物质进行分解，通过控制静置时间为15-20分钟后进行高温灭菌，停止分解，既防止多酚物质的含量过高对酵母菌发酵产生抑制作用，又确保了多酚物质能够增强酵母的抗氧化能力，促进酵母的代谢活性，提高其发酵效率和生物活性，从而使制得的酿酒酵母培养物对仔猪的生长发育更加有利。