靶向淀粉样蛋白并降低炎症反应的CAR及其应用、核酸、载体、巨噬细胞和小胶质细胞的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种靶向淀粉样蛋白并降低炎症反应的car及其应用、核酸、载体、巨噬细胞和小胶质细胞。

背景技术：

1、1. 靶向淀粉样β蛋白（amyloid-β，aβ）的抗体或融合蛋白治疗阿兹海默病（alzheimer’s disease，ad）

2、2021年，美国fda批准上市了世界上第一款靶向aβ的药物阿杜那单抗（aducanumab），可以降低ad病人的脑部aβ斑块的沉积，并且降低了病人的认知和记忆能力的衰退速度。在阿杜那单抗之后，美国fda于2023年批准了第二款靶向aβ的药物仑卡奈单抗（lecanemab），并于2024年7月批准了第三款靶向aβ的药物多奈单抗（donanemab），此外还有多个单克隆抗体药物正处于临床研究阶段，如gantenerumab。

3、2022年，hyuncheol等人报道了融合蛋白αaβ–gas6，充当aβ和小胶质细胞tam受体家族的桥梁，使小胶质细胞在清除aβ蛋白同时不引起免疫炎症反应。

4、以上技术的缺点：①抗体在激活小胶质细胞吞噬aβ的同时，会诱导小胶质细胞释放促炎细胞因子，产生副作用；②大多数抗体在临床实际治疗效果较差；③抗体或者融合蛋白在实际应用时需多次给药，增加了患者的治疗成本。

5、2. 细胞疗法治疗阿兹海默病

6、2023年，priyanka等人报道了通过造血干细胞移植替换ad小鼠模型的小胶质细胞，实现了小鼠脑部aβ蛋白的减少以及认知能力的改善。

7、该技术的缺点：①移植的造血干细胞分化的小胶质细胞未经过改造，靶向aβ蛋白的能力较低；②造血干细胞为前体细胞，在体内会随机分化为其他类型的细胞，可能会造成移植物抗宿主病等风险。

8、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种靶向淀粉样β蛋白的嵌合抗原受体（car），该嵌合抗原受体能够显著提高小胶质细胞吞噬并清除aβ蛋白的能力；诱导小胶质细胞产生抑炎免疫反应，降低神经炎症反应；为阿兹海默病的治疗提供新的方案。

2、本发明的第二目的在于提供上述嵌合抗原受体的应用。

3、本发明的第三目的在于提供一种核苷酸。

4、本发明的第四目的在于提供一种载体。

5、本发明的第五目的在于提供一种巨噬细胞。

6、本发明的第六目的在于提供一种小胶质细胞。

7、为了实现以上目的，特采用以下技术方案：

8、第一方面，本发明提供了一种靶向淀粉样β蛋白的嵌合抗原受体，从n端至c端依次包括胞外域、cd8a的铰链域、cd8a的跨膜域和胞内域；

9、所述胞外域从n端至c端依次包括cd8a的信号肽和抗淀粉样β蛋白的scfv；所述scfv的氨基酸序列如seq id no.1所示；

10、所述胞内域包括tyro3的胞内域、axl的胞内域或mertk的胞内域；

11、所述嵌合抗原受体为人的嵌合抗原受体或鼠的嵌合抗原受体；

12、所述人的嵌合抗原受体中，cd8a的信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，cd8a的铰链域的氨基酸序列如seq id no.3所示，cd8a的跨膜域的氨基酸序列如seq id no.4所示，tyro3的胞内域的氨基酸序列如seq id no.5所示，axl的胞内域的氨基酸序列如seq idno.6所示，mertk的胞内域的氨基酸序列如seq id no.7所示；

13、所述鼠的嵌合抗原受体中，cd8a的信号肽的氨基酸序列如seq id no.8所示，cd8a的铰链域的氨基酸序列如seq id no.9所示，cd8a的跨膜域的氨基酸序列如seq id no.10所示，tyro3的胞内域的氨基酸序列如seq id no.11所示，axl的胞内域的氨基酸序列如seqid no.12所示，mertk的胞内域的氨基酸序列如seq id no.13所示。

14、作为进一步技术方案，所述嵌合抗原受体还包括荧光标签；

15、所述荧光标签包括egfp。

16、作为进一步技术方案，所述荧光标签通过连接肽与胞内域链接；

17、所述连接肽的氨基酸序列如seq id no.14所示。

18、第二方面，本发明提供了上述嵌合抗原受体在如下a或b中的应用：

19、a. 制备清除淀粉样β蛋白的产品；

20、b. 制备降低神经炎症反应的产品。

21、第三方面，本发明提供了一种核苷酸，所述核苷酸包括编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

22、第四方面，本发明提供了一种载体，所述载体携带所述的核苷酸。

23、第五方面，本发明提供了一种巨噬细胞，所述巨噬细胞携带所述的核苷酸，或者含有所述的载体，或者表达所述的嵌合抗原受体。

24、该巨噬细胞可以以抗原依赖的方式，靶向吞噬淀粉样β蛋白，并降低神经炎症反应。

25、第六方面，本发明提供了一种小胶质细胞，所述小胶质细胞携带所述的核苷酸，或者含有所述的载体，或者表达所述的嵌合抗原受体。

26、该小胶质细胞可以以抗原依赖的方式，靶向吞噬淀粉样β蛋白，并降低神经炎症反应。

27、作为进一步技术方案，所述小胶质细胞为诱导多能干细胞分化得到，包括以下步骤：

28、将诱导多能干细胞于第一培养基中培养，诱导拟胚体形成；然后将拟胚体在第二培养基中培养，诱导造血干祖细胞的分化，之后在第三培养基中培养，诱导造血干祖细胞的产生并诱导其向髓系分化，最后将分化出的造血干祖细胞收集，并在第四培养基中培养诱导分化为小胶质细胞；

29、所述第一培养基包括：人bmp4 10ng/ml、y-27632 10μm和stemdiff™ apel™2培养基；

30、所述第二培养基包括：人bmp4 10ng/ml、人fgf-2 10ng/ml、人scf 100ng/ml、人vegf-a 50ng/ml和stemdiff™ apel™2培养基；

31、所述第三培养基包括：人fgf-2 10ng/ml、人scf 50ng/ml、人vegf-a 50ng/ml、人il-3 25ng/ml、人m-csf 50ng/ml、人gm-csf 50ng/ml、人igf-1 10ng/ml和stemdiff™apel™2培养基；

32、所述第四培养基包括：its-g 2 wt %、谷氨酰胺1x（gibco，35050061）、非必需氨基酸1x（gibco, 11140050）、巯基乙醇 100μm、b27 2 wt %（gibco, 17504044）、n2 2 wt %（gibco, 17502001）、人m-csf 50ng/ml、人il-34 50ng/ml、人tgf-beta 1 50ng/ml和dmem/f12培养基；

33、所述第二培养基培养的时间为4-6天；

34、所述第三培养基培养的时间为22-26天。

35、作为进一步技术方案，所述第二培养基每3天更换一次；

36、所述第三培养基每2天更换一次。

37、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

38、本发明提供的靶向淀粉样β蛋白的嵌合抗原受体，在巨噬细胞中表达能够提高巨噬细胞对aβ的吞噬能力。在小胶质细胞中表达能够使得小胶质细胞具有靶向aβ的能力，显著提高了aβ的吞噬能力，同时降低神经炎症反应；可以通过多能干细胞在体外分化得到大量的小胶质细胞，且体外分化得到的小胶质细胞为终末分化的细胞，成分明确，用于细胞移植不会造成移植物抗宿主病等风险。