一种稳定表达反刍动物SLAM蛋白的人胚肾细胞系及其构建方法和应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种稳定表达反刍动物slam蛋白的人胚肾细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、小反刍兽疫(peste des petits ruminants,ppr)是由小反刍兽疫病毒(pestedes petits ruminants virus,pprv)引起的小反刍动物高度传染性病毒性疾病，对山羊、绵羊等经济动物和岩羊、白尾鹿等野生反刍动物的健康造成巨大危害。联合国粮食及农业组织和世界动物卫生组织已将ppr确定为全球根除疫病。pprv的流行病学研究和疫苗研发是防控和根除ppr最重要的两个部分。无论是流行病学研究中涉及的病毒分离，还是疫苗研发中涉及的毒株扩繁，都需要用到细胞系。

2、小反刍兽疫病毒的受体为slam，其自然宿主反刍动物的slam能有效介导pprv感染与增殖。然而，构建稳定表达多种反刍动物slam的细胞系是技术难题，且目前已知的构建方法难以构建出稳定表达slam蛋白且高效介导pprv感染与增殖的细胞系。因此，亟需开发一种能稳定表达反刍动物slam蛋白且高效介导pprv感染与增殖的细胞系的构建方法。

技术实现思路

1、为开发一种能稳定表达反刍动物slam蛋白且高效介导pprv感染与增殖的细胞系的构建方法，本发明提供了一种稳定表达反刍动物slam蛋白的293t细胞系及其构建方法和应用。本发明成功构建获得了稳定表达反刍动物的slam蛋白的细胞系，能够明显介导pprv分的感染和增殖，有用于制备疫苗的潜力。

2、本发明提供了一种稳定表达反刍动物slam蛋白的293t细胞系的构建方法，包括如下步骤：

3、从反刍动物全基因数据库中下载所需反刍动物的slam基因，在slam基因的3’端引入ha标签，获得slam-ha目的基因，然后将slam-ha目的基因连接在cd513b-cherry慢病毒载体上，转化dh5α感受态细胞，提取阳性质粒获得慢病毒载体质粒；

4、所述cd513b-cherry慢病毒载体构建过程为：将cd513b质粒的gfp荧光报告基因替换成cherry荧光报告基因，同时在cherry基因前面加入htlv启动子，获得cd513b-cherry慢病毒载体；

5、将获得的慢病毒载体质粒与辅助质粒pmdlg/prre、prsv-rev、pmd2.g混合后，共转染293t细胞，获得包装好的slam慢病毒；

6、将slam慢病毒转导至人肾上皮细胞后获得稳定表达反刍动物slam蛋白的人肾上皮细胞系。

7、进一步地，所述慢病毒载体质粒的构建过程为：以慢病毒载体cd513b-cherry为模板，以seq id no.13所示的上游引物和seq id no.14所示的下游引物扩增获得片段1；以seq id no.15所示的上游引物和seq id no.16所示的下游引物扩增获得片段3；

8、然后利用融合pcr技术融合片段1、slam-ha目的基因和片段3，使得slam-ha目的基因连接在慢病毒载体cd513b-cherry上，转化dh5α感受态细胞，提取阳性质粒获得慢病毒载体质粒。

9、进一步地，所述反刍动物为爪哇鼷鹿、长颈鹿、林麝、白尾鹿、美洲羚羊和山羊中的任意一种。

10、进一步地，所述爪哇鼷鹿的slam基因序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.7所示；

11、所述长颈鹿的slam基因序列如seq id no.2所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seqid no.8所示；

12、所述林麝的slam基因序列如seq id no.3所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seqid no.9所示；

13、所述白尾鹿的slam基因序列如seq id no.4所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seqid no.10所示；

14、所述美洲羚羊的slam基因序列如seq id no.5所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.11所示；

15、所述山羊的slam基因序列如seq id no.6所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seqid no.12所示。

16、进一步地，当反刍动物为爪哇鼷鹿时，扩增其slam-ha目的基因的引物对如seq idno.23-seq id no.24所示；

17、当反刍动物为长颈鹿时，扩增其slam-ha目的基因的引物对如seq id no.19-seqid no.20所示；

18、当反刍动物为林麝时，扩增其slam-ha目的基因的引物对如seq id no.27-seq idno.28所示；

19、当反刍动物为白尾鹿时，扩增其slam-ha目的基因的引物对如seq id no.21-seqid no.22所示；

20、当反刍动物为美洲羚羊时，扩增其slam-ha目的基因的引物对如seq id no.25-seq id no.26所示；

21、当反刍动物为山羊时，扩增其slam-ha目的基因的引物对如seq id no.17-seq idno.18所示。

22、进一步地，slam慢病毒包装过程为：将获得的慢病毒载体质粒与辅助质粒pmdlg/prre、prsv-rev、pmd2.g按照3:1:1:1混合后得质粒混合物，质粒混合物再与转染试剂turbofact混匀孵育，然后将细胞培养基弃掉，用无血清的opti-mem培养基洗涤，再加入1ml2％fbsdmem，将孵育完成的质粒混合物转染后包装培养，收集培养液，离心，收集上清，即获得包装好的slam慢病毒。

23、进一步地，所述质粒混合物与转染试剂turbofact用量比为3ug：6μl。

24、进一步地，离心条件为：4℃离心10min。

25、本发明提供了一种slam慢病毒，所述slam慢病毒由上述方法中slam慢病毒包装而成。

26、本发明还提供了一种所述的slam慢病毒在制备ppr诊断试剂和/或疫苗中的应用。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

28、1、本发明提供的方法构建获得了稳定表达爪哇鼷鹿、长颈鹿、林麝、白尾鹿、美洲羚羊和山羊的slam蛋白的细胞系，证明了爪哇鼷鹿、长颈鹿、林麝、白尾鹿、美洲羚羊和山羊的slam介导pprv感染和增殖的效率。与不表达slam的细胞相比，表达这6种反刍动物slam的hek-293t能够明显介导pprv分的感染和增殖，其一pprv致293t-slam细胞系的病变时间比致293t-cherry细胞病变明显，其二293t-slam细胞系中病毒滴度比293t-cherry细胞提高100倍左右。

29、2、采用慢病毒系统将反刍动物slam基因稳定整合在293t细胞基因组染色体上，使其具有良好的遗传稳定性，不易丢失。构建的293t-slam细胞系生长速度快，易于培养，除了满足科学研究所需的小规模使用外，还可满足疫苗生产中的大批量使用。