一种重组硫酸软骨素外切酶突变体、重组菌及其应用

本发明属于酶工程领域，具体地涉及一种重组硫酸软骨素外切酶突变体、重组菌及其应用。

背景技术：

1、硫酸软骨素是一种天然来源的生物活性大分子，属于糖胺聚糖类。硫酸软骨素有许多生物学功能，如抗关节炎、抗氧化、促进创面愈合、抗凝血及血栓、抑制癌细胞、调节肠道菌群等。由于硫酸软骨素存在分子量大、亲水基团多、脂溶性差等结构特点，导致其体内吸收不完全，生物利用度低（小于13%）。目前硫酸软骨素类资源的应用难点，已经不在提取，而在于降低分子量，以解决其难吸收、生物利用度低等问题。

2、高分子量硫酸软骨素的降解方法主要有酶降解、氧化降解、酸降解。酸降解原理是多糖在有机或无机酸中，通过糖苷键被破坏来获得相对低分子量聚糖。该方法通常会导致硫酸基的脱落，破坏硫酸软骨素降解后的主体结构和产物活性成分，从而限制了该方法的应用。氧化降解原理是通过h2o2或催化h2o2产生氧自由基攻击糖苷键而获得低分子量硫酸软骨素的方法。这种方法产率低、整个过程复杂、难以控制，限制了该方法的应用。酶降解原理是通过消除机理作用于二糖重复单元之间糖苷键并将其切断，酶解产物为寡糖，主要是不饱和二糖。与其他降解法相比，酶法降解反应条件温和、反应过程可控、具有高度特异性。通过所述的重组硫酸软骨素外切酶降解硫酸软骨素是一种得到低分子量硫酸软骨素的有效方法。

3、目前已有报道的硫酸软骨素酶普遍存在酶活较低的问题，在进行产业化生产时，酶添加量较多，生产复杂，因此，高酶活的硫酸软骨素外切酶是实现低分子量硫酸软骨素产业化制备的前提，此外，利用微生物宿主发酵制备重组硫酸软骨素外切酶是能够降低生产成本、获得高效重组硫酸软骨素外切酶的有效方法。

技术实现思路

1、本发明的针对上述技术问题提供一种重组硫酸软骨素外切酶突变体、重组菌及其应用，所述的重组硫酸软骨素外切酶突变体提高了酶的活性，能够满足产业化应用。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种重组硫酸软骨素外切酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no. 1所示；具体为：

4、mthevsrrhilqgtaaltfaglltagfaplaqaaeaatpanldalaerwvdqitgrllidpadpdfgaaiasqdravdksvsllaprplkmgvftdapfsseaqmvtsygrlaqmaaawatpgskhqgspvlldqilgaledgntyiyndgqaeygnnwsweigtskaatdtlailgsnvspdliakycaaidhfipdptkqfpdsrgkilseganrvdicqaiivrsivggdtarlaaaisalspvhqyvtsgngfyadgsfvqhttipytgtygvvllgglaklfsllggsdhavsdpsrtilfntvedsfapflhdglmmdsvrgraisrtqergfddgtitieailwlaravdattgnrmralckgwvarnqysnplagasiprtallkelaasatdaaaetaghsffpghdrsvyrgkgwaaalglssrrttwyecgngennlgaqtgsgmtylyagnqghfdddfwptanlsrlpgitvdttplppkvegengaatphnewtggvtlngtgavgmhlvgpggtglqarkawfytqdmvvalgadihtasgaavesimehrnlgadggqamtvdgrphtaaagtpvsyghprwahlegtggylllgegdltvlreqrtgakkdintggtpavvsrqyatllfehgtdpasyayailpgasamdtakaagksaprvlrndktgqgleldkkttaalfwapgtvgnltadgpacvlfngnpghgvlavvdptqtatsvtvtirdaryirisvtvgatllvdrdgnvtitiptagllgatvevtlhr。

5、编码seq id no. 1所述氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no. 2所示，所述seqid no. 2是在原始氨基酸序列seq id no. 3的硫酸软骨素外切酶基础上，翻译为编码的核苷酸序列，并通过pcr扩增及测序获得该核苷酸序列的基因片段，对该基因片段进行易错pcr反应获得的突变体。

6、编码重组硫酸软骨素外切酶突变体的基因如下（seq id no. 2）：

7、atgacacatgaagtcagccggagacatatccttcaaggaactgccgctttgacctttgccggattgttgacggctggatttgctccactggcacaagcagctgaagcagcaacgccagccaatttggacgctctagccgaacgatgggttgaccaaataactggccgcctcttgatcgaccccgctgatcctgatttcggtgccgccatcgcttctcaagatagggccgtcgataagagtgtttcattgttggccccaagacccttgaagatgggtgtgttcacggatgccccattctcatcggaagctcagatggtgacttcctacggtcgcttagctcaaatggccgcggcttgggctaccccaggttccaagcaccaaggatcacccgtgttgttagaccaaatcttgggagccttagaggacggaaatacttatatttacaacgatggacaagctgagtacggaaataactggagctgggagatcggaacaagtaaagctgctacggacaccctagctattctagggtccaacgtttctcccgacttgattgctaaatactgtgctgccatcgatcattttatccccgaccccactaagcaatttcctgattctcgaggtaagattctgtcagaaggcgctaatagagtcgatatttgtcaagctattatagttaggtcaatagttggtggtgacaccgctcgtctcgccgcagcaatctccgctctgtctccagtgcaccagtatgttacttccggtaatggattttatgctgacggctcatttgtacaacacactaccattccatatacaggaacttacggtgtagttttgttgggaggactcgctaagttgttctcgttgctgggtggatctgatcacgctgtttccgatcctagtaggacaattttgtttaatacagttgaggattcttttgctccatttcttcatgacggtttgatgatggattcggtacgaggtcgtgccatctcgcgtacccaagagagagggttcgatgatggaactataaccattgaagccattttatggctagctcgggcggtcgacgctaccacgggcaacaggatgcgtgctctttgcaaaggttgggtggcgagaaatcagtatagtaacccacttgccggtgcttcgattccaaggacagctctcttgaaggaactcgccgccagtgccaccgatgcagctgccgagactgccggacactcgttctttcctggacatgacagatcagtgtacagaggcaaaggttgggccgccgcacttggtttatcatcaaggagaactacgtggtatgaatgcggtaatggggaaaataatctcggcgctcaaacgggtagtggtatgacttatttgtatgctggtaatcagggacactttgacgatgatttttggccaactgccaacttgtccagattaccaggaattactgtggatactacaccactaccgccaaaggtggagggagaaaatggtgctgctactccccataatgagtggacgggtggtgtcactttgaatggcactggcgctgtcggtatgcacttggtcggaccgggtgggacgggtttgcaagctaggaaagcttggttctatacacaagatatggtcgtagctctaggtgccgatatccatactgctagtggtgctgctgtcgaatccattatggagcatagaaatttgggcgccgacggaggtcaggcaatgaccgttgatggtcgcccccatacagctgctgctggtacacctgtatcttacggccacccaagatgggctcatctggagggtaccggtggatacttattactgggtgaaggtgatcttacagtactgcgagaacaaaggactggagctaaaaaggacatcaataccggaggtactccagccgtggtttcacgacaatatgcaactttgttatttgaacacggtacggatcctgctagttacgcttatgccatattgcctggtgcttctgccatggacacggctaaagccgccgggaagagcgcaccaagagtactgagaaatgataagactgggcaaggactcgagttagacaagaagaccacagcagcccttttctgggctcctggaacagttggaaacttaacagcagatggacccgcttgcgttttgtttaatgggaaccccggtcatggtgttctggcggtcgtcgatcctactcaaaccgcaacttccgttacagtgactattagagatgctcgttacattagaatatctgtgactgtgggtgctaccctcctcgtggatcgtgatggtaacgtcactatcaccatacccacagcaggattgttgggagcaacagttgaggtcactcttcaccga。

8、原始硫酸软骨素外切酶的氨基酸序列（seq id no. 3）：

9、mthevsrrhilqgtaaltfaglltagfaplaqaaeaatpanldalrerwvdqitgrllidpadpdfkaaiasqdravdksvsllaprpgkmgvftdapfsseaqmvtsykrlaqmaaawatpgskhqgspvlldqilgaledgntyiyndgqaeygnnwsweigtskaatdtlailgsnvspdliakycaaidhfipdptkqfpdsrgkilseganrvdicqaiivrsivggdtarlaaaisalspvhqyvtsgngfyadgsfvqhttipytgtygvvllgglaklfsllggsdhavsdpsrtilfntvedsfapflhdglmmdsvrgraisrtqergfddgtitieailwlaravdattgnrmralckgwvarnqysnplagasiprtallkelaasatdaaaetaghsffpghdrsvyrgkgwaaalglssrrttwyecgngennlgaqtgsgmtylyagnqghfdddfwptanlsrlpgitvdttplppkvegengaatphnewtggvtlngtgavgmhlvgpggtglqarkawfytqdmvvalgadihtasgaavesimehrnlgadggqamtvdgrphtaaagtpvsyghprwahlegtggylllgegdltvlreqrtgakkdintggtpavvsrqyatllfehgtdpasyayailpgasamdtakaagksaprvlrndktgqgleldkkttaalfwapgtvgnltadgpacvlfngnpghgvlavsdptqtatsvtvtirdaryrrisstvgatlsvdrdgnvtitiptagllgrtvevtlhr。

10、本发明还提供一种硫酸软骨素外切酶的重组表达载体，所述重组表达载体包含上述重组硫酸软骨素外切酶基因，载体为毕赤酵母。

11、本发明还提供一种硫酸软骨素外切酶的重组菌，所述重组菌包含上述重组硫酸软骨素外切酶基因，菌株为毕赤酵母x33。

12、本发明发明还提供一种酶制剂，所述酶制剂包含所述硫酸软骨素外切酶的突变体或/和硫酸软骨素外切酶的重组菌。

13、本发明还提供所述硫酸软骨素外切酶的突变体、重组表达载体和重组菌的应用，所述应用为利用所述突变体、重组表达载体或/和重组菌制备低聚骨素。

14、优选的，所述的应用以骨为原料。

15、本发明还提供所述方法制备的低聚骨素在制备修复骨关节炎或骨损伤药物或保健品中的应用。

16、本发明还提供一种保健品，所述保健品包括所述应用方法制备的低聚骨素。

17、本发明与现有技术相比的有益效果：

18、1、本发明通过易错pcr的方法得到了一种重组硫酸软骨素外切酶，构建其在毕赤酵母中的重组表达载体突变库。

19、2、本发明将重组硫酸软骨素外切酶在毕赤酵母x33中异源表达，获得该重组硫酸软骨素外切酶表达产物，具备重组硫酸软骨素外切酶在毕赤酵母x33中的制备方法。

20、3、本发明表征了重组硫酸软骨素外切酶表达产物的酶活力水平，重组硫酸软骨素外切酶相较于原序列硫酸软骨素外切酶，酶活显著性提升。

21、4、本发明所述的重组硫酸软骨素外切酶可用来制备低聚骨素的产品，利用本发明所述的重组硫酸软骨素外切酶，相比较利用原始硫酸软骨素外切酶，相同酶解条件下，底物用酶量8-15 u/g，重组硫酸软骨素酶添加量约为原始硫酸软骨素酶添加量的三十五分之一，制备低分子量硫酸软骨素的效果相当。同时，使用此酶解技术所得低聚骨素中的低分子量硫酸软骨素分子量分布更集中。

22、5、本发明所述的利用重组硫酸软骨素外切酶制备的低聚骨素产品，可显著性提升软骨细胞增殖率，促进软骨细胞的增殖与再生；可修复骨关节炎大鼠的软骨损伤，具有明显的促软骨细胞增殖和改善骨关节炎功效。