针对C-KIT的人源化抗体的制作方法

本技术涉及针对c-kit的人源化抗体。

背景技术：

1、c-kit(cd117)是一种iii型受体酪氨酸激酶，其与干细胞因子(scf)结合，干细胞因子是导致某些类型细胞生长的物质，也称为“钢因子”或“c-kit配体”。当这种受体与干细胞因子结合时，其形成二聚体，从而激活其固有的酪氨酸激酶活性，进而磷酸化并激活在细胞中传播信号的信号转导分子。c-kit是用于鉴定骨髓中某些类型的hspc的细胞表面标志物。造血干细胞(hsc)、多能祖细胞(mpp)和普通骨髓祖细胞(cmp)表达高水平的c-kit。已经提出在干细胞替代疗法中可以使用抗c-kit抗体以消融内源性细胞(wo2016033201、wo2008067115)。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供了特异性结合人c-kit的抗体，其包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，除了存在1、2或3个cdr残基取代以外，所述成熟重链可变区包含分别为seq id no：2-4的由kabat定义的cdr h1、h2和h3，所述成熟轻链可变区包含分别为seq id no：6-8的由kabat定义的cdr l1、l2和l3，所述取代选自重链位置60处的n至a、重链位置64处的k至q、和轻链位置30处的n至q，这些位置根据kabat编号。

2、任选地，除了存在重链位置64处的k至q和轻链位置30处的n至q的取代以外，由kabat定义的cdr h1、h2和h3分别为seq id no：2-4，由kabat定义的cdr l1、l2和l3分别为seq id no：6-8。

3、任选地，除了存在重链位置60处的n至a、重链位置64处的k至q、和轻链位置30处的n至q的取代以外，由kabat定义的cdr h1、h2和h3分别为seq id no：2-4，由kabat定义的cdrl1、l2和l3分别为seq id no：6-8，。

4、任选地，成熟重链可变区与seq id no：13、17或21(ah2、ah3或ah4)显示出至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性，成熟轻链可变区与seq id no：53(nl2)显示出至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性，条件是与所示seq id no的任何变化在cdr之外。

5、任选地，通过kabat编号的重链位置1是e。任选地，成熟轻链可变区的以下位置被如下氨基酸占据：位置9被l占据，位置12被p占据，位置14被t占据，位置15被p占据，位置18被p占据，位置20被s占据，位置22被s占据，位置37被l占据，位置43被s占据，位置45被q占据，位置74被k占据，位置77被r占据，位置78被v占据，位置79被e占据，位置84被g占据。任选地，除了位置1可以是e以外，成熟重链可变区具有选自seq id no：13、17或21的序列，并且成熟轻链可变区具有seq id no：53的序列。任选地，成熟重链可变区与重链恒定区连接，并且成熟轻链可变区与成熟轻链恒定区连接。任选地，重链恒定区是人igg1。任选地，抗体相对于amg191具有增强的与人c-kit的结合。任选地，抗体相对于amg191-igg1具有增强的adcp。任选地，抗体相对于amg191-igg1具有增强的adcc。

6、本发明还提供了药物组合物，其包含如上所述的抗体和药学上可接受的载体。

7、本发明还提供了消融内源性hspc的方法，其包括向需要消融的受试者施用如上所述的抗体的有效方案。

8、本发明还提供了治疗表达c-kit的癌症的方法，其包括向患有所述癌症的受试者施用如上所述的抗体的有效方案。

9、定义

10、单克隆抗体或其他生物实体通常以分离的形式提供。这意味着抗体或其他生物实体相对于由其生产或纯化引起的干扰蛋白和其他污染物，通常具有至少50％w/w的纯度，但不排除单克隆抗体与过量的药学上可接受的载体或旨在促进其使用的其他媒介物组合的可能性。有时，单克隆抗体相对于来自生产或纯化的干扰蛋白和污染物的纯度为至少60％、70％、80％、90％、95％或99％w/w。通常，分离的单克隆抗体或其他生物实体是其纯化后剩余的主要大分子物质。

11、特异性结合是在数量上可检测地更高于并且可区别于发生在至少一个不相关靶标上的非特异性结合。特异性结合可以是在特定官能团之间或特定空间配合(例如，锁和钥匙类型)之间形成键的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定意味着抗体结合一个且仅一个靶标。本发明的抗体通常以至少108、109、1010、1011或1012m-1的亲和力特异性结合c-kit。

12、基本的抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括多肽链的两个相同配对，每对具有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。该可变区最初被表达为与可裂解的信号肽连接。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是指没有轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应物功能的恒定区。

13、轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别定义为igg、igm、iga、igd和ige。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“j”区相连，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“d”区。通常参见，fundamental immunology,paul,w.,ed.,2nd ed.raven press,n.y.,1989,ch.7(通过引用全文并入用于所有目的)。

14、免疫球蛋白轻链或重链可变区(在本文中分别也称为“轻链可变结构域”(“vl结构域”)或“重链可变结构域”(“vh结构域”))由被三个“互补决定区”或“cdr”中断的“框架”区组成。框架区用于排列cdr以与抗原表位特异性结合。cdr包括主要负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端，vl和vh结构域均包含以下框架(fr)区和cdr区：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。vl结构域的cdr 1、2和3在本文中也分别称为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3；vh结构域的cdr 1、2和3在本文中也分别称为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。

15、氨基酸在每个vl和vh结构域的分配是根据cdr的任何常规定义。常规定义包括kabat定义(kabat，sequences of proteins of immunological interest(nationalinstitutes of health，bethesda，md，1987和1991)，chothia定义(chothia&lesk,j.mol.biol.196:901-917,1987；chothia et al.,nature342:878-883,1989)；chothiakabat cdr的复合，其中cdr-h1是chothia和kabat cdr的复合；牛津分子的抗体建模软件所使用的abm定义；以及martin等人的联系定义(world wide web bioinfo.org.uk/abs)。kabat提供了广泛使用的编号惯例(kabat编号)，其中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基分配了相同的编号。除非另有说明，否则抗体可变区内的位置编号是kabat编号。当通过某一定义的cdr(例如kabat)提及抗体包含cdr时，该定义指定了抗体中存在的cdr残基(kabat cdr)的最小数量。不排除落入另一个常规cdr定义内但在指定定义外的其他残基也存在。例如，包含由kabat定义的cdr的抗体包括其他可能性，即其中cdr包含kabat cdr残基而没有其他cdr残基的抗体，以及其中cdr h1是复合chothia-kabat cdr h1并且其他cdr包含kabat cdr残基且无基于其他定义的额外cdr残基的抗体。

16、术语“抗体”包括完整的抗体及其结合片段。通常，片段与衍生出其的完整抗体竞争与靶标的特异性结合，包括分离的重链、轻链fab、fab'、f(ab')2、f(ab)c、dab、纳米抗体和fv。片段可以通过重组dna技术产生，或通过酶促或化学方法分离完整的免疫球蛋白而产生。术语“抗体”还包括双特异性抗体和/或人源化抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体(参见例如，songsivilai andlachmann,clin.exp.immunol.,79:315-321(1990)；kostelny et al.,j.immunol.,148:1547-53(1992))。

17、示例性的双特异性抗体也可以是：(1)双可变域抗体(dvd-lg)，其中每条轻链和重链通过短肽连接包含串联的两个可变结构域(wu et al.,generation andcharacterization of a dual variable domain immunoglobulin(dvd-igtm)molecule,in:antibody engineering,springer berlin heidelberg(2010))；(2)tandab，其是两个单链双抗体的融合物，从而产生四价双特异性抗体，该四价双特异性抗体对每个靶抗原具有两个结合位点；(3)柔性抗体(flexibody)，其是scfv与双抗体的组合，从而产生多价分子；(4)基于蛋白激酶a中“二聚化和对接结构域”的所谓的“对接和锁定”分子，其在应用于fab时，可以产生三价双特异性结合蛋白，该蛋白由两个连接至不同fab片段的相同fab片段组成；或(5)所谓的蝎型分子(scorpion molecule)，包括例如与人fc区的两个末端融合的两个scfv。可用于制备双特异性抗体的平台的实例包括bite(micromet)、dart(macrogenics)、fcab和mab2(f-star)、fc工程化igg1(xencor)或duobody(基于fab的臂交换，genmab)。

18、术语“表位”是指抗原上抗体结合的位点。表位可以由连续氨基酸或由通过一种或多种蛋白质的三级折叠而并列的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，更通常至少5或8至10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如，epitope mapping protocols,in methods in molecular biology,vol.66,glenne.morris,ed.(1996)。

19、抗体之间的竞争通过其中待测抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的测定法来确定(参见例如，junghans et al.,cancer res.50:1495,1990)。如果如竞争性结合测定中测得的过量测试抗体(例如至少2x、5x、10x、20x或100x)将参考抗体的结合抑制至少50％，则测试抗体与参考抗体竞争。一些测试抗体将参考抗体的结合抑制至少75％、90％或99％。通过竞争测定法鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体，以及与参考抗体结合的表位足够接近的邻近表位结合以发生空间位阻的抗体。

20、术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂或助剂与制剂的其他成分兼容并且对其接受者基本上无害，和/或此类载体、稀释剂、赋形剂或助剂经fda批准或可批准用于包含在对人肠胃外给药的药物组合物中。

21、术语“受试者”包括接受预防或治疗性处理的人和其他哺乳动物受试者。

22、为了将氨基酸取代分类为保守或非保守，将氨基酸分为以下几组：第一组(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；第二组(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；第三组(酸性侧链)：asp、glu；第四组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；第五组(影响链取向的残基)：gly、pro；和第六组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代涉及相同类别氨基酸之间的取代。非保守取代涉及将这些类别之一的成员替换为另一类别的成员。

23、序列同一性百分比由通过kabat编号惯例最大对齐的抗体序列确定。对齐后，如果将目标抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，则目标抗体区域和参考抗体区域之间的序列同一性百分比为在目标抗体区域和参考抗体区域中相同氨基酸占据的位置的数量除以两个区域的对齐位置的总数(未计算缺口)，乘以100即可转换成百分比。

24、“包含”或“包括”一个或多个所列举的要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其他要素。例如，“包含”或“包括”抗体的组合物可以单独或与其他成分组合包含抗体。

25、值的范围的指定包括该范围内或限定该范围的所有整数，以及由该范围内的整数所限定的所有子范围。

26、除非从上下文中另外明显看出，否则术语“约”涵盖非实质变化，例如在所述值的标准误差测量值(例如sem)范围内的值。

27、统计学显著性是指p＜0.05。

28、人源化抗体是基因工程化抗体，其中来自非人“供体”抗体的cdr被嫁接到人“受体”抗体序列中(参见例如，queen,us 5,530,101和5,585,089；winter,us 5,225,539；carter,us 6,407,213；adair,us 5,859,205；和foote,us 6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟的人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区域序列。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的cdr以及完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)的抗体。当各个cdr之间至少85％、90％、95％或100％的相应残基(如kabat所定义)相同时，人源化抗体中的cdr基本上来自非人抗体中的相应cdr。当至少85％、90％、95％或100％的由kabat定义的相应残基与人类受体序列相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。

29、本发明还涉及以下实施方案:

30、1.特异性结合人c-kit的抗体，其包含成熟重链可变区和成熟的轻链可变区，除了存在1、2或3个cdr残基取代以外，所述成熟重链可变区包含分别为seq id no：2-4的由kabat定义的cdr h1、h2和h3，所述成熟轻链可变区包含分别为seq id no：6-8的由kabat定义的cdr l1、l2和l3，所述取代选自重链位置60处的n至a、重链位置64处的k至q、和轻链位置30处的n至q，这些位置根据kabat编号。

31、2.实施方案1的抗体，其中除了存在重链位置64处的k至q和轻链位置30处的n至q的取代以外，由kabat定义的cdr h1、h2和h3分别为seq id no：2-4，并且由kabat定义的cdrl1、l2和l3分别为seq id no：6-8。

32、3.实施方案1的抗体，其中除了存在重链位置60处的n至a、重链位置64处的k至q、和轻链位置30处的n至q的取代以外，由kabat定义的cdr h1、h2和h3分别为seq id no：2-4，由kabat定义的cdr l1、l2和l3分别为seq id no：6-8。

33、4.前述实施方案中任一项的抗体，其中所述成熟重链可变区与seq id no：13、17或21(ah2、ah3或ah4)显示出至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性，并且所述成熟轻链可变区与seq id no：53(nl2)显示出至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性，其中与所示seq id no的任何变化在由kabat定义的cdr之外。

34、5.实施方案4的抗体，其中通过kabat编号的重链位置1是e。

35、6.前述实施方案中任一项的抗体，其中所述成熟轻链可变区的以下位置被如下氨基酸占据：

36、位置9被l占据

37、位置12被p占据

38、位置14被t占据

39、位置15被p占据

40、位置18被p占据

41、位置20被s占据

42、位置22被s占据

43、位置37被l占据

44、位置43被s占据

45、位置45被q占据

46、位置74被k占据

47、位置77被r占据

48、位置78被v占据

49、位置79被e占据

50、位置84被g占据。

51、7.实施方案1的抗体，其中除了位置1可以是e以外，所述成熟重链可变区具有选自seq id no：13、17或21的序列，并且所述成熟轻链可变区具有seq id no：53的序列。

52、8.前述实施方案中任一项的抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与成熟轻链恒定区连接。

53、9.实施方案7的抗体，其中所述重链恒定区是人igg1。

54、10.前述实施方案中任一项的抗体，其相对于amg191具有增强的与人c-kit的结合。

55、11.前述实施方案中任一项的抗体，其相对于amg191-igg1具有增强的adcp。

56、12.前述实施方案中任一项的抗体，其相对于amg191-igg1具有增强的adcc。

57、13.药物组合物，其包含前述实施方案中任一项的抗体和药学上可接受的载体。

58、14.消融内源性hspc的方法，其包括向需要消融的受试者施用前述实施方案中任一项的抗体的有效方案。

59、15.治疗表达c-kit的癌症的方法，其包括向患有所述癌症的受试者施用前述实施方案中任一项的抗体的有效方案。