一种预防犬瘟热病毒感染的融合蛋白和疫苗及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，特别是免疫药物，具体涉及一种预防犬瘟热病毒感染的融合蛋白和疫苗及其应用等。

背景技术：

1、犬瘟热病毒（canine distemper virus, cdv）是一种属于副粘病毒科、麻疹病毒属的单股负链rna病毒，是全球范围内威胁犬科动物健康的主要病原体之一。cdv不仅感染犬类，还可感染其他食肉目动物，如狐狸、狼、浣熊等，甚至对某些灵长类动物也具有感染性。犬瘟热是由cdv引起的一种急性、高度接触性传染病，以发热、呼吸道症状、消化道症状和神经系统症状为主要特征。

2、犬瘟热病毒感染不仅直接危害动物健康，还常与其他病原体如细菌、真菌等形成继发感染，加重疾病程度。近年来，随着宠物数量的增加和野生动物栖息地的破坏，cdv感染在全球范围内呈上升趋势，已成为威胁动物福利和生态平衡的重要问题之一。

3、安全有效的疫苗被认为是预防和控制cdv感染的最佳措施。cdv的主要抗原蛋白包括血凝素蛋白（hemagglutinin protein，h蛋白）、融合蛋白（fusion glycoprotein，f蛋白）、核蛋白（nucleoprotein，n蛋白）等。其中，h蛋白是病毒表面的主要糖蛋白，负责病毒与宿主细胞的吸附，是诱导产生中和抗体的主要抗原。cdv的h蛋白结构较为特殊，n端位于病毒内侧，c端位于病毒外侧，类似于真核细胞的ii类跨膜蛋白。

4、目前市场上主要的cdv疫苗类型为减毒活疫苗。虽然减毒活疫苗通过多次传代使病毒毒力减弱，但仍有毒力返强的风险，并且目前市售的减毒活疫苗保护效果不佳。为了克服现有疫苗的局限性，研究人员正在积极开发新型cdv疫苗。例如，现有技术专利cn109867713b（授权公告日2022-07-26）公开了一种犬瘟热病毒h蛋白的亚单位疫苗，专利cn108704128b（授权公告日2022-06-21）介绍了一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗。这些亚单位疫苗均采用全长h蛋白，利用昆虫细胞-杆状病毒系统进行体外表达、纯化。这种方式存在交叉免疫保护差、成本高、产量低的问题，无法顺利推广。

5、因此，目前仍然迫切需要一种新的犬瘟热疫苗，解决当前疫苗开发中存在的问题。相较于传统疫苗开发，核酸疫苗（nucleic acid vaccine）是更好的选择。目前已有大量研究证明，核酸疫苗具有多项优势：（1）不携带毒力病毒颗粒，也不存在毒力返祖现象，安全性更高；（2）可以在细胞内完成抗原蛋白表达，从而诱发机体对该蛋白的体液免疫和细胞免疫，能够增强免疫效果，延长有效保护的持续时间，无需多次重复加强免疫；（3）可以还原抗原的空间构象，提供更多、更准确的空间表位，增加免疫原性；（4）接种后，抗原蛋白在细胞内表达，能够直接与组织相容性复合物mhci或ii类分子结合，不受母源抗原干扰。

6、因此，本领域亟需一种提供更优的构象表位、具备交叉免疫保护效果、降低生产成本的cdv疫苗，以使得疫苗更容易在全球范围内推广使用。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种新的犬瘟热病毒疫苗分子架构设计和应用，具体提供一种可预防犬瘟热病毒感染的截选肽段、融合蛋白、免疫原性组合物、疫苗、编码其的重组核酸、基因表达盒、载体、宿主细胞、制备方法以及制药用途等。本发明从开发cdv核酸疫苗的角度出发，对cdv h蛋白做出适当截选，并且筛选出合适的四聚体功能元件连接在h蛋白胞外结构域的n端，用以促使其在表达过程中自组装为四聚体形式，还原天然四聚体构象。本发明截选的cdv h蛋白肽段，能够和不同的元件组合，设计而成的核酸疫苗均能在真核细胞中顺利表达，且具有免疫原性。此外，本发明优选的四聚体元件和截选的cdv h蛋白序列组成的融合蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导高水平体液免疫反应，同时还能诱导细胞免疫，并提供针对不同cdv毒株的交叉免疫保护。

2、本发明的一方面提供一种犬瘟热病毒（canine distemper virus, cdv）血凝素蛋白（hemagglutinin glycoprotein，h蛋白）的截选肽段。

3、进一步地，所述的截选肽段的氨基酸序列如seq id no.5或seq id no.9所示。

4、本发明的另一方面提供一种融合蛋白，其特征在于，包含所述的截选肽段。

5、进一步地，所述融合蛋白从从n端到c端，包含如下元件：

6、（a）四聚体结构域；优选地，所述四聚体结构域是来源于泉古菌属（staphylothermus）的四聚体结构域；更优选地，所述泉古菌属（staphylothermus）的四聚体结构域的氨基酸序列如seq id no.4所示；和

7、（b）所述的截选肽段。

8、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白的n端含有信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

9、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白的n端含有fc domain；优选地，所述fcdomain的氨基酸序列如seq idno.10所示。

10、进一步地，其特征在于，所述元件之间可选地通过linker序列连接，优选地，linker序列为gs linker或ggs linker；优选地，所述gs linker的氨基酸序列如seq idno.6所示，所述ggs linker的氨基酸序列如seq id no.7所示。

11、本发明的另一方面提供一种重组核酸分子，其特征在于，编码本发明所述截选肽段和/或融合蛋白。

12、本发明的另一方面提供一种重组基因表达盒，其特征在于，包含所述重组核酸分子。

13、本发明的另一方面提供一种重组载体，其特征在于，包含所述重组核酸分子、或所述重组基因表达盒。

14、本发明的另一方面提供一种重组宿主细胞，其特征在于，包含所述重组核酸分子、或所述重组基因表达盒、或所述重组载体。

15、本发明的另一方面提供一种免疫原性组合物或药物组合物，其特征在于，包含一种或多种任一项所述截选肽段和/或融合蛋白，和/或一种或多种所述重组核酸分子，和/或一种或多种所述重组基因表达盒，和/或一种或多种所述重组载体，和/或一种或多种所述重组宿主细胞；优选地，所述免疫原性组合物或药物组合物还包含药学上可接受的载体。

16、本发明的另一方面提供一种重组疫苗，其特征在于，包含一种或多种任一项所述截选肽段和/或融合蛋白，和/或一种或多种所述重组核酸分子，和/或一种或多种所述重组基因表达盒，和/或一种或多种所述重组载体，和/或一种或多种所述重组宿主细胞，和/或一种或多种所述免疫原性组合物或药物组合物；优选地，所述疫苗为核酸疫苗。

17、本发明的另一方面提供一种或多种所述截选肽段和/或融合蛋白的制备方法，其特征在于，采用所述的重组宿主细胞表达所述截选肽段和/或融合蛋白，并分离所述截选肽段和/或融合蛋白。

18、本发明的另一方面提供一种或多种所述截选肽段和/或融合蛋白，和/或一种或多种所述重组核酸分子，和/或一种或多种所述重组基因表达盒，和/或一种或多种所述重组载体，和/或一种或多种所述重组宿主细胞，和/或一种或多种所述免疫原性组合物或药物组合物，和/或一种或多种所述重组疫苗在制备预防犬瘟热病毒引起的疾病的药物中的用途；优选地，所述疾病为犬瘟热疾病。

19、本发明的另一方面提供一种疾病的预防方法，其特征在于，给予受试者预防有效量的一种或多种所述截选肽段和/或融合蛋白，和/或一种或多种所述重组核酸分子，和/或一种或多种所述重组基因表达盒，和/或一种或多种所述重组载体，和/或一种或多种所述重组宿主细胞，和/或一种或多种所述免疫原性组合物或药物组合物，和/或一种或多种所述重组疫苗；优选地，所述疾病为犬瘟热病毒引起的疾病。

20、本发明的融合蛋白、免疫原性组合物、重组疫苗等具有如下有益技术效果：

21、1. 本发明发现新的融合分子具有良好的免疫原性，并且能够提供免疫保护效果，可同时作为核酸疫苗或亚单位疫苗的通用抗原架构。本发明的免疫原性组合物，具有良好的免疫原性，可针对犬瘟热病毒感染提供有效的免疫保护，相较于传统活疫苗，安全性高，制备成本低，有利于市场推广。

22、2. 本发明发现基于cdv全长h蛋白设计的核酸疫苗无法在真核细胞中表达，难以激活动物的体液免疫；而基于本发明的cdv截短肽段能够与不同的元件组合形成新的融合分子，在真核细胞中顺利表达并分泌，并能够有效激活动物的体液免疫。且截短cdv h蛋白截选肽段1为最优选择。

23、3. 本发明从开发cdv核酸疫苗的角度出发，筛选多种功能性元件连接在cdv h蛋白截选肽段的n端，最终选取出还原h蛋白天然四聚体构象的四聚体功能元件，在组成融合蛋白后不仅能够顺利表达，并且具有强免疫原性。本发明从多种不同的四聚体结构域中进行筛选，选出分泌效率最高的泉古菌属四聚体结构域，其与cdv h蛋白截选肽段融合后更有利于抗原呈递和体液免疫的激活。

24、4. 本发明实施例4表明，基于本发明的融合分子能够有效促进cdv的h蛋白在真核细胞中顺利表达、分泌，且表达的蛋白结构正确、稳定，有利于免疫表位呈递，从而进一步提高免疫保护效果，为麻疹类病毒的通用疫苗设计领域提供新技术。

25、5. 本发明实施例5表明，在豚鼠模型中，基于本发明的疫苗d免疫后能够诱导4/5个体产生中和抗体，且3/5个体产生的中和抗体具有针对cdv1和cdv3的交叉免疫保护效果，即针对不同cdv毒株可提供交叉免疫保护。本发明的重组核酸疫苗b、c能够在豚鼠模型中诱导针对cdv1毒株的有效免疫保护。

26、6. 本发明实施例6表明，在黑貉（犬科）模型中，本发明的融合蛋白具有良好的免疫原性，基于本发明的核酸疫苗能够为靶动物黑貉提供有效的免疫保护，针对犬瘟热病毒感染有良好的预防效果。虽然基于本发明的核酸疫苗d在实施例5中两次免疫后，只在4/5只黑貉中检测到高水平的中和抗体，但是在实施例6攻毒实验显示5只黑貉均成功存活。推测疫苗d不仅诱导体液免疫，同时还能诱导细胞免疫，在cdv强毒攻击时能获得完全保护。