一种基于外泌体亲和色谱技术筛选中药抗结肠癌活性成分的方法

本发明属于药物筛选，具体涉及一种基于外泌体亲和色谱技术筛选中药抗结肠癌活性成分的方法。

背景技术：

1、外泌体（exosome）作为细胞间信息交流的天然载体，在蛋白质质量控制、发育、免疫、组织稳态、癌症和神经退行性疾病等多种生理过程和疾病中发挥重要作用。同时，因其出色的生物相容性、低免疫原性、高效的药物负载和靶向递送能力，使外泌体在炎症性肠病治疗领域备受关注。肿瘤细胞来源的外泌体（tumor derived exosomes，tdes）因其独特的“归巢”能力，在肿瘤治疗领域已被视为极佳的天然药物载体。通过其携带的特异性蛋白质和核酸等内容物，tdes可以调节免疫细胞活性和传递抑制性信号，进而显著影响免疫系统的反应。此外，病毒也利用外泌体生物发生途径来组装感染性粒子和建立宿主的易感性。基于以上这些独特特性，外泌体正被开发为多种疾病模型中的治疗剂。

2、亲和色谱法是一种以生物相关结合剂为固定相的液相层析方法，其通过利用在许多生物相互作用中发生的选择性和可逆结合来分离和纯化特定靶标，这包括抗体与抗原、酶与底物、激素与受体之间的相互作用。亲和色谱法的选择性和简单性可以使它高效的纯化许多生物分子、生物药品和一些其他试剂。亲和色谱法不但可以用于样品制备，也可以分离或测量生物活性成分。

3、结肠癌(crc)是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，通常源于结肠息肉，可能导致消化系统功能障碍。结肠癌是全球重大的健康问题，是癌症相关死亡的第二大原因。传统的癌症治疗方法，如手术、放疗和化疗，面临着局限性和副作用，治疗手段仍然十分有限，因此，急需开发或发现新的癌症治疗药物。

4、大部分药物的肿瘤靶向性较差且缺乏特异性，不仅限制了药物的治疗效果，而且容易引起较为严重的不良反应。此外，在结肠癌肿瘤组织中通常存在多种免疫抑制信号。利用外泌体可以调节免疫细胞活性和传递抑制性信号的特点，筛选出的治疗药物，可以改善药物的靶向性。

5、因此，本发明旨在构建一种创新利用外泌体作为载体材料的亲和色谱的药物筛选方法，用于高效筛选中药中对结肠癌细胞有抑制作用的活性成分。本研究不仅有助于深入了解外泌体的作用机理，而且为抑制结肠癌的活性成分筛选提供了新的思路和方法，从而为保障公众健康做出贡献。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于外泌体亲和色谱技术筛选中药抗结肠癌活性成分的方法，该方法能够高效且精确的实现筛选抑制结肠癌细胞的活性成分。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

3、1、一种基于外泌体亲和色谱技术筛选中药抗结肠癌活性成分的方法，包括以下步骤：

4、（1）外泌体亲和色谱载体材料的制备：首先将戊二醛与分散在pbs缓冲液中的氨基二氧化硅在室温下振在荡器震荡反应一定时间，使在氨基二氧化硅上加入醛基，离心后水洗过滤，加入结肠癌细胞外泌体共孵育一定时间，使氨基二氧化硅的醛基与外泌体的羧基共价结合，再加入赖氨酸震荡一定时间，用以封闭二氧化硅上多余的醛基，得到外泌体二氧化硅（tdes@sio2）亲和色谱载体材料。（2）中药抗结肠癌成分的方法的筛选：中药抗结肠癌活性成分的筛选：采用亲和色谱法分离能够与癌细胞外泌体结合的中药成分。首先将中药提取物溶解后按照一定浓度体积加入到由（1）得到的tdes@sio2亲和色谱载体材料中，使中药提取物与tdes@sio2亲和色谱载体材料共孵育一定时间，离心取出未吸附的上清液，为未吸附液。采用适宜溶剂洗脱一定时间得到与tdes@sio2结合的溶液，为洗脱液。将中药提取物初始液、未吸附液、洗脱液分别注入高效液相色谱仪中检测，通过分析不同溶液中成分峰面积的变化，筛选出中药与tdes@sio2结合的成分；采用液质联用对与外泌体结合的成分进行鉴定；通过测定筛选并鉴定出的结合成分对结肠癌细胞的半数抑制浓度，最终得到具有抗结肠癌作用的活性成分。

5、优选的，步骤（1）所述的外泌体亲和色谱载体材料的制备方法，其特征在于：所述中药提取物溶液浓度为0.5 mg/ml。

6、优选的，步骤（1）所述的外泌体亲和色谱载体材料的制备方法，其特征在于：所述中药提取物与tdes@sio2共孵育时间为30分钟。

7、优选的，步骤（1）所述的外泌体亲和色谱载体材料的制备方法，其特征在于：所述外泌体来源于ht-29结肠癌细胞。

8、优选的，步骤（1）中，所述tdes@sio2外泌体亲和色谱载体材料制备步骤如下：将氨基二氧化硅分散于pbs缓冲液中，加入戊二醛震荡活化2小时，水洗涤3次，然后加入外泌体，将混合物置于振荡器中震荡4小时，使外泌体固定在sio2表面，再加入溶解在pbs缓冲液中的赖氨酸，将混合物震荡反应2小时，通过离心分离复合混合物，用水洗涤3次后得到tdes@sio2载体材料，最后pbs缓冲液（ph=7.4）分散保存。

9、优选的，步骤（2）中所述的中药抗结肠癌成分的方法的筛选方法，其特征在于：所述使用适宜溶剂洗脱30分钟得到与tdes@sio2结合的溶液。

10、优选的，步骤（2）中所述的中药抗结肠癌成分的方法的筛选方法，其特征在于：所述亲和色谱方法具体为：色谱柱为ymc-pack ods-a c18 (4.6 × 250 mm)，检测波长为254nm，流动相a为0.1%磷酸，流动相b为乙腈，梯度洗脱程序为0 min-95% a；10 min-75% a；15min-65% a；30 min-55% a；50 min-55% a；60 min-95% a，柱温为35 ℃，波长为220 nm，流速为1 ml/min。

11、优选的，步骤（2）中所述的中药抗结肠癌成分的方法的筛选方法，其特征在于：所述液质联用方法具体为：色谱柱为c18 (3.5 μm; 2.1 mm × 50 mm)，流动相a为0.1%甲酸，流动相b为甲醇，梯度洗脱程序为0 min-70% a；4 min-70% a；14 min-52% a；24 min-52%a；25 min-70% a；30 min-70% a。雾化器压力为35 psi，干燥气体流速为8 l/min，气体温度为320℃，鞘气温度为350℃，气体流速为11 l/min，质量范围选择为50-3000（m/z）。

12、由上述技术方案可知，本发明提供了一种基于外泌体亲和色谱技术筛选中药抗结肠癌活性成分的方法，属于药物筛选技术领域。该方法第一步使用戊二醛在氨基二氧化硅上加入醛基，然后与来源于结肠癌细胞外泌体共孵育，再以赖氨酸封闭氨基二氧化硅中多余的醛基，形成tdes@sio2亲和色谱载体材料；第二步将待筛选中药提取物与亲和色谱载体材料共孵育一定时间，离心除去未吸附液后，采用适宜溶剂洗脱得到洗脱液；采用高效液相分析对比中药提取物初始液、未吸附液、洗脱液各峰面积的变化，从而筛选出与外泌体有吸附作用的中药成分；第三步，采用液质联用技术对筛选出的中药成分进行鉴定；第四步，采用细胞实验确定中药成分对结肠癌细胞生长的抑制作用，从而高效且准确的筛选出抗结肠癌活性成分。