冻存脐带血造血干细胞来源的NK细胞的制备方法与流程

本发明涉及一种冻存脐带血造血干细胞来源的nk细胞的制备方法，属于免疫细胞。

背景技术：

1、nk细胞，全称为自然杀伤细胞（natural killer cells），是一类重要的免疫细胞，属于先天免疫系统的核心成员。它们的主要功能是识别并杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞，是机体抗肿瘤和抗病毒的第一道防线。目前nk细胞可以通过以下几种途径获取：外周血单个核细胞（pbmcs）、脐带血（ucb）、诱导多能干细胞（ipscs）、nk细胞系、骨髓、胚胎干细胞（escs）等。其中脐带血来源的nk细胞具有以下优点：采集时供体无痛苦和风险；含有较多的未成熟的免疫细胞，易于培养和激活；增殖能力和骨髓归巢能力强；较低的免疫原性和gvhd风险；对肿瘤微环境的适应性更强，能够更好地适应不同肿瘤的内部环境，提高治疗效果。这些优点使得脐带血来源的nk细胞正在成为免疫治疗领域的一个重要方向。但是，利用冷冻后的脐带血造血干细胞培养nk细胞是当前的难点。

2、众所周知，冷冻后的脐带血细胞是很脆弱的，其中的免疫细胞更加的脆弱，在程控降温和复苏过程中，细胞膜和主要的细胞器膜均可能存在冰晶损伤，而且细胞表面很多受体蛋白可能在冷冻复苏过程中脱落，从而会影响细胞的增殖。同时，脐带血细胞在解冻时，死细胞（主要是粒细胞）极易聚集并形成团块，使得与活细胞难于分离，影响后续的培养过程，这点是目前大多数文献未考虑到的。冷冻过的脐带血再进行提取单个核细胞（cbmc）与新鲜脐带血提取单个核细胞相比诱导成nk细胞步骤是不同的，原因是经过冷冻后细胞变得比较脆弱，需要在提取单个核细胞后迅速恢复并激活其中的免疫细胞，使其诱导成nk细胞。有文献报道使用4℃预冷的复苏溶液复苏冻存脐带血造血干细胞，但细胞在37℃的水浴解冻而后又加入4℃预冷的复苏溶液会使细胞（尤其是其中的免疫细胞）变得更加脆弱。发明专利申请cn117286101 a公开了一种高效扩增冻存脐带血中自然杀伤细胞的方法，其使用的是动物细胞培养基，在临床上使用存在动物源成分的安全问题，而且其混有大量红细胞，会影响免疫细胞的后续生长，且存在扩增倍数低的问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种冻存脐带血造血干细胞来源的nk细胞的制备方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种冻存脐带血造血干细胞来源的nk细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、（一）脐带血复苏：取冻存脐带血，水浴快速融化，加入37℃的复苏溶液（事先温浴好）；离心，弃上清，得血样；

5、（二）分离脐带血单个核细胞：使用淋巴细胞分离液分离脐带血单个核细胞，并加入氯化铵溶液裂解红细胞，采用清洗溶液洗涤，得单个核细胞；

6、（三）nk细胞的诱导制备：向经lymactin-nk包被的培养瓶中加入激活培养基，将脐带血单个核细胞接种至培养瓶，加入il-21、il-18、抗凋亡剂、bdnf、ngf、tpo和sdf-1（添加后，il-21、il-18、抗凋亡剂、bdnf、ngf、tpo和sdf-1的浓度分别为20 ng/ml、10 ng/ml、20mm、50μg/ml、50μg/ml、50μg/ml和50μg/ml），置于5%co2、37℃恒温培养箱中培养；培养的第3天和第5天，补加激活培养基；培养的第7天开始，每2天补加扩增培养基；培养的第17～20天收集细胞，即得nk细胞；

7、所述激活培养基是由kbm581培养基和il-15组成的，il-15的浓度为20 ng/ml；

8、所述扩增培养基是由kbm581培养基和il-2组成的，il-2的浓度为1000 iu/ml。

9、进一步地，所述步骤（一）中，水浴融化时的水浴温度为40℃。

10、进一步地，所述步骤（一）中，复苏溶液是由以下溶液配制而成的：140 ml的0.9%（mg/ml）氯化钠注射液，50 ml的复方电解质溶液，10 ml的人血白蛋白溶液（人血白蛋白的浓度为20%，g/l）。

11、进一步地，所述步骤（一）中，加入37℃的复苏溶液时，边摇晃边匀速加入且持续时间不少于3分钟。

12、进一步地，所述步骤（一）中，复苏溶液的加入量为脐带血体积的8倍。

13、进一步地，所述步骤（二）中，氯化铵溶液的浓度为0.8%（单位：g/100ml）。

14、进一步地，所述步骤（二）中，清洗溶液是通过以下方法配制而成的：向200 ml的0.9%氯化钠溶液中加入2 ml的dnaseⅰ溶液（1 mg/ml）和1.5 ml的mgcl2溶液（25 mm），混匀，即得。

15、进一步地，所述步骤（二）的具体操作如下：

16、（1）铺层加样：血样以2:1比例缓慢匀速加入到人淋巴细胞分离液上层，离心；

17、（2）提取单个核细胞：离心后，离心管内出现明显的分层，吸取单个核细胞层（白膜层）；

18、（3）第一遍洗涤：向单个核细胞中加入等体积的清洗溶液，离心，弃上清，得细胞沉淀；

19、（4）裂解红细胞：加入3倍（体积倍数）的浓度为0.8%的氯化铵溶液稀释细胞沉淀，混匀，4℃裂解10 min，得裂解液；

20、（5）第二遍洗涤：向裂解液中加入清洗溶液终止裂解并洗涤，离心，弃上清，得细胞沉淀；

21、（6）第三遍洗涤：加入清洗溶液洗涤细胞，离心，弃上清，即得单个核细胞。

22、进一步地，所述步骤（三）中，包被的具体方式为：用4 ml的pbs缓冲液和1 ml的lymactin-nk溶液包被非tc处理的t75培养瓶1 h以上，去除包被液，用pbs缓冲液清洗掉残留的包被液。

23、进一步地，所述步骤（三）中，培养的第3天补加的激活培养基的量为：初始激活培养基的90%～110%，优选100%。

24、进一步地，所述步骤（三）中，培养的第5天补加的激活培养基的量为：初始激活培养基的350%～450%，优选400%。

25、进一步地，所述步骤（三）中，培养的第7天开始，每隔2天补加扩增培养基以调整细胞密度为2×106/ml。

26、利用上述方法制备得到的nk细胞。

27、本发明的冻存脐带血造血干细胞来源的nk细胞的制备方法，采用37℃提前温浴好的复苏溶液复苏脐带血细胞，并在洗涤过程中使用清洗溶液，清洗溶液含有氯化钠、dnase和mgcl2，防止细胞结团。加入氯化铵溶液裂解红细胞，以减少红细胞对后续培养的影响。利用此方法获得数量足够、状态良好、细胞潜能良好的脐带血单个核细胞后，在激活时加入多种激活因子（抗细胞凋亡剂、bdnf、ngf、sdf-1、tpo等），促使细胞恢复冻存前的状态，使其被诱导并被激活，最终经培养获得nk细胞。

28、本发明的冻存脐带血造血干细胞来源的nk细胞的制备方法，具有以下优势：

29、（1）本发明使用37℃提前温浴好的复苏保护液复苏脐带血细胞，相比于文献报道的4℃预冷后的复苏保护液，能够更好的保护细胞。

30、（2）经过冷冻后的脐带血复苏后比较脆弱，不适合长时间在实验室环境下进行ficoll法的分离，会影响单个核细胞的富集和最终细胞的状态，但不经ficoll法分离会残留大量的红细胞，本发明经过多次尝试，使用ficoll法提取脐带血单个核细胞，提取脐带血单个核细胞的清洗过程中使用清洗溶液，清洗溶液中含有氯化钠、dnase和mgcl2，可防止细胞结团，能够保护单个核细胞的富集和最终的细胞状态。在离心前加入氯化铵溶液裂解红细胞，极大的降低了红细胞对后续培养的影响。

31、（3）相比于新鲜的脐带血单个核细胞，从冷冻过的脐带血中提取单个核细胞最重要的就是尽可能恢复其细胞状态到新鲜细胞状态。本发明在常规培养nk细胞方法的基础上，在激活当天再加入一些细胞因子（如抗细胞凋亡剂、bdnf、ngf、sdf-1、tpo等），加入的抗细胞凋亡剂在细胞培养过程中发挥着重要作用，它们通过抑制细胞凋亡过程来维持细胞的生存和功能。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，对于去除损伤或不再需要的细胞至关重要，然而，在细胞培养中，过度的细胞凋亡可能导致细胞数量减少，影响实验结果，在细胞培养过程中，抗细胞凋亡剂的使用可以帮助维持细胞的稳定状态。

32、（4）本发明后续培养仅采用kbm581培养基加il-2扩增培养基，在节约成本的同时，极大地提高冷冻后脐带血复苏培养nk的扩增倍数并保持其表型同新鲜脐血nk细胞。

33、（5）除此之外本发明的制备方法为纯因子培养法，无滋养层细胞，所使用的试剂均为市售试剂，无需灭菌处理，不含动物源成分，可达到临床级别。

34、本发明的冻存脐带血造血干细胞来源的nk细胞的制备方法，对于存储了脐带血（而未被应用于治疗或者不属于脐带血造血干细胞治疗技术的适应证范畴）的储户而言多了一份选择，可以选择培养nk细胞。随着技术的发展，nk细胞治疗的潜力会大大提高，而nk细胞治疗的疾病种类也会随之提高。对于社会而言，公共脐血库在使用时需要配型，但同时也存在使用不上的情况，会存在比较大的资源浪费；本发明能够解决目前公共血库现状，同时提高了nk细胞的扩增效率和产量，降低治疗成本，使得更多的患者能够负担得起这种治疗，使得更多的脐带血被充分利用，市场前景广阔。总之，脐带血来源的nk细胞治疗作为一种新兴的免疫疗法，具有巨大的潜力和广阔的应用前景。通过不断研究和技术创新，克服现有的技术瓶颈，可以进一步推动nk细胞治疗的发展，为患者带来更多的治疗希望。同时，这也将促进生物医药产业的发展，为社会经济带来积极的影响。

35、本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。