一种全层皮肤模型及其构建方法与应用

本发明属于生物医用材料，具体涉及一种全层皮肤模型及其构建方法与应用。

背景技术：

1、目前大多数的药物和化妆品测试需要依赖于二维细胞水平和动物实验进行，但是二维的细胞培养水平，无法正确的反映细胞之间以及细胞外基质的交互作用，所以目前所采用的皮肤3d模型，主要是指利用工程学材料和对应的细胞生物学的原理方法，在体外制备的模拟化的全层皮肤结构。良好的全层皮肤模型需要与正常皮肤结构高度类似，首先需要具有完整的表皮层和真皮结构，其次在生物学特性上需要具有良好的机械效能和稳定性，可用来替代体外人原代细胞的3d培养体系，从而检测对应不同炎症条件下的病理生理特性；也可用来替代人体皮肤组织进行药物、化学分子的安全性和功效性的评估。

2、在仿生3d皮肤组织研究中，需要找到适宜的真皮基质成分，使其具有相似的生物相容性，合适的机械特性，内在的材料孔径可支持细胞增殖、迁移、黏附。因此真皮层体外构建方案是重要的一个研究环节，目前常用的真皮基质，主要为特殊材料的生物基质胶配制。但目前以生物基质胶为基质的体外皮肤3d模型存在以下缺点：降解效率快、回缩性和机械性能不稳定，导致体外模型的不可重复性，从而影响了长时间炎症刺激和抑制模型的构建。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种全层皮肤模型及其构建方法与应用。所述的全层皮肤模型的真皮层通过生物基质胶与成纤维细胞混合，可用于模拟正常及炎症状态下的真皮结构，并有利于上层角质形成细胞的黏附，使制备得到的全层皮肤模型降解效率低，结构稳定，更具有仿生性能，可用于慢性、炎症性疾病的治疗及机制研究。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种生物基质胶，包括以下浓度的组分：0.5-10μg/ml埃洛石纳米管、1.5％-5％海藻酸钠、8-12mg/ml透明质酸、3-8mg/ml i型胶原、5-15μmol/l氯化钙和10×dmem粉末。

3、本技术发明人经过大量的实验发现，通过在dmem粉末中添加埃洛石纳米管、海藻酸钠、透明质酸、i型胶原和氯化钙进行复配，形成本技术的生物基质胶，该生物基质胶能够促进成纤维细胞分泌丰富的细胞外基质，促进成纤维细胞增殖、迁移，增加真皮层的机械强度和厚度；并且有利于表皮角质形成细胞的黏附，使接种后的表皮细胞正常增殖分化，形成复层的上皮样结构，有利于全层皮肤模型的快速构建。此外，经实验发现，本发明的生物基质胶具有促进创口愈合，缩短上皮化的生物活性，能够用于各种组织的再生和修复。

4、其中，埃洛石纳米管是一种天然存在的铝硅酸盐纳米管，具有独特的多层管状结构，其外径通常在50至70纳米之间，长度从200纳米到几微米不等，表面积大，内含中空管腔，这些结构特征赋予埃洛石纳米管高表面积和增强的机械强度。本技术在生物基质胶中添加埃洛石纳米管，使得埃洛石纳米管在与细胞成分和生长因子的相互作用中表现出色，有助于细胞的附着和增殖。埃洛石纳米管的粗糙表面提供了更多的接触面积，促进细胞的锚定和扩展。表面的氢氧基可以与细胞表面蛋白质形成氢键，增强细胞粘附和信号传导。此外，埃洛石纳米管改善的机械性能影响细胞内的机械传导途径，刺激细胞增殖和迁移，从而提供了一个类似自然细胞外基质的微环境，支持细胞活动和组织再生。

5、在生物基质胶中添加氯化钙，起到促进交联的作用，促进生物基质胶结构的形成。本技术的生物基质胶中还添加有海藻酸钠、制备的生物基质胶达到稳定状态；加入透明质酸和i型胶原，使得生物基质胶具有更佳促进创口愈合，缩短上皮化的生物活性的优点，用于各种组织的再生和修复。加入dmem粉末，共同混入细胞培养环境，可以调节生物基质胶的酸碱度。

6、优选地，所述dmem粉末还有含饱和碳酸氢钠，以调节生物基质胶的酸碱度。

7、本技术发明人研究发现，上述浓度范围的组分复配组成的生物基质胶更有利于成纤维细胞增殖、迁移，更有利于表皮角质形成细胞的黏附，使接种后的表皮细胞正常增殖分化，形成复层的上皮样结构，有利于全层皮肤模型的快速构建。

8、作为本发明所述生物基质胶的优选实施方式，所述生物基质胶中埃洛石纳米管的浓度为0.8-5μg/ml，透明质酸的浓度为9-11mg/ml。

9、本技术采用上述浓度范围的埃洛石纳米管和透明质酸，加入至生物基质胶中，具有更好的机械性能，更有利于细胞的附着和增殖、迁移，使得生物基质胶可以更好地促进创口愈合，缩短上皮化的生物活性，有利于各种组织的再生和修复。

10、作为本发明所述生物基质胶的优选实施方式，所述生物基质胶中埃洛石纳米管的浓度为1μg/ml，透明质酸的浓度为10mg/ml。

11、埃洛石纳米管和透明质酸采用上述最优选的浓度，可以更有利于成纤维细胞增殖、迁移，更有利于表皮角质形成细胞的黏附，使接种后的表皮细胞正常增殖分化，形成复层的上皮样结构，有利于全层皮肤模型的快速构建。

12、本发明还提供所述的生物基质胶在构建皮肤真皮层或全层皮肤模型中的应用。

13、采用本技术配方设计的生物基质胶可以促进成纤维细胞分泌丰富的细胞外基质，有利于皮肤真皮层的形成；同时采用本技术的生物基质胶有利于表皮角质形成细胞的黏附，使接种后的表皮细胞正常增殖分化，形成复层的上皮样结构，有利于全层皮肤模型的快速构建。

14、本发明还提供所述的生物基质胶在制备促进组织再生和修复的制剂中的应用。

15、本发明还提供一种皮肤真皮层的构建方法，将培养后的原代成纤维细胞消化离心后，获得成纤维细胞悬液，在成纤维细胞悬液中加入所述的生物基质胶，混匀后进行孵育成型，再加入完全培养基进行培养得到。

16、作为本发明所述皮肤真皮层的构建方法的优选实施方式，所述原代成纤维细胞的密度为5-10×105个/ml。

17、作为本发明所述皮肤真皮层的构建方法的优选实施方式，所述成纤维细胞悬液和生物基质胶的体积比为10：9。

18、作为本发明所述皮肤真皮层的构建方法的优选实施方式，所述孵育具体为于37℃，5％ co2培养箱孵育15min。

19、本发明还提供一种皮肤真皮层模型，采用所述的皮肤真皮层的构建方法构建得到。

20、本发明还提供一种全层皮肤模型的构建方法，包括以下步骤：

21、s1.制备成纤维细胞；

22、s2.在成纤维细胞中加入所述的生物基质胶，混匀得细胞-胶预混液；吸取细胞-胶预混液于培养皿中，培养孵育成型，再加入完全培养基静置培养，得真皮层；

23、s3.将培养后的表皮细胞消化并接种于s2的真皮层，加入完全培养基进行培养，得所述全层皮肤模型。

24、作为本发明所述全层皮肤模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤s3中的表皮细胞的接种密度为1×106个/cm2。

25、作为本发明所述全层皮肤模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤s3中的培养具体为每隔2天更换培养液，并再次接种表皮细胞于表面，连续培养5天。

26、作为本发明所述全层皮肤模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤s2和s3中的完全培养液以dmem粉末为基础液，并添加10％ fbs和1％双抗。

27、作为本发明所述全层皮肤模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤s2和s3中的培养条件为37℃，5％ co2。

28、本发明还提供采用所述的构建方法构建得到的全层皮肤模型。

29、本发明还提供所述的全层皮肤模型在化妆品或者药品的安全性或功效性评价中的应用。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、1、本发明提供过一种全层皮肤模型，其包括真皮层和表皮层，降解效率低，结构稳定，且具有仿生性能，可模拟人体皮肤结构；且全层皮肤模型的构建方法操作简单，耗时短，成本低，构建得到的皮肤3d模型稳定，可用于慢性、炎症性疾病的治疗及机制的研究；

32、2、本发明的全层皮肤模型中的真皮层由成纤维细胞与生物基质胶孵育得到，所述生物基质胶包括埃洛石纳米管、海藻酸钠、透明质酸、i型胶原、氯化钙和dmem粉末，能够明显促进真皮层成纤维细胞分泌丰富的细胞外基质，增加了真皮层可持续性的机械强度和厚度，用于模拟正常及炎症状态下的真皮结构，并有利于上层角质形成细胞的黏附，有利于全层皮肤模型的构建；

33、3、动物实验证明，本发明的全层皮肤模型中的生物基质胶具有促进伤口愈合、缩短上皮化时间的功能，可用于组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生等。