一种病毒DNA、RNA共提取试剂盒及提取方法与流程

本技术涉及一种病毒dna、rna共提取试剂盒及提取方法，属于生物。

背景技术：

1、病毒按照基因组的类型不同，分为dna病毒和rna病毒。dna和rna共提取的关键在于裂解液，dna的提取方法有sds法、胍盐法。鉴于rna的提取需要消除rna酶的影响（rna酶广泛存在，而且很难消除），而高浓度的胍盐可以灭活rna酶，因此胍盐法很适合既提取dna，又提取rna的实验。

2、利用磁珠法提取核酸的应用已经很广泛，磁珠在吸附核酸时，会优先吸附大片段的核酸，因为大片段的核酸所带负电荷的量更多。因此病毒核酸的片段大小不同，被磁珠吸附的难易程度不同。小病毒的核酸片段相应较小，因此更难吸附，例如猪圆环病毒、hbv病毒。因此提取小病毒的核酸，对试剂的要求更高。现在市场上的试剂盒难以兼顾所有种类病毒的提取，尤其是小病毒的提取，在小病毒核酸提取时的性能比较差，存在漏检现象。

3、而且，目前存在的同时提取病毒dna和rna的试剂盒往往需要设置不同的洗脱温度或者洗脱液，导致提取步骤繁琐，因此目前需要一种步骤简单的能同时提取病毒dna和rna，适用范围宽广，能兼顾小病毒核酸的提取方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种操作简单、适用范围广泛的dna、rna共提取试剂盒，包括如下成份：裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液、磁珠和rna助沉剂；其中，裂解液包括异硫氰酸胍1m-6m，盐酸胍2-7m，10-500 mm tris-hcl（(ph为7.5~8.5)）、100-1000 mm氯化钠、5-100mmedta-2na(ph为7.5~8.5)、1%-30%的吐温20(v/v)、十二烷基肌氨酸钠0.5-2%(m/v)；漂洗液1包括1~3 m异硫氰酸胍或盐酸胍、5-500mm tris-hcl(ph为7.5~8.5)、5%-10%的吐温20（v/v）、100-600mm的nacl。优选地，所述10-500 mm tris-hcl的ph值为8.0，5-100mmedta-2na的ph值为8.0。

2、在本发明的实施例中，漂洗液2包括75~80%（v/v）的乙醇。结合液为醇类中的至少一种，优选地，所述结合液选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的至少一种，更优选地，所述结合液为异丙醇。

3、在本发明的实施例中，磁珠为硅羟基磁珠，磁珠用量为1-3mg，磁珠的粒径为300nm，优选地，所述磁珠的浓度为50mg/ml，用量为20-60μl。

4、在本发明的实施例中，洗脱液为：depc水。

5、在本发明的实施例中，rna助沉剂为carrier rna，所述助沉剂用量为3-12μg。

6、在本发明的优选实施例中，病毒dna/rna共提取试剂盒，所述提取试剂盒包括以下组分：

7、裂解液，所述裂解液包括2m异硫氰酸胍，4m盐酸胍，50 mm tris-hcl(ph=8)、150mm氯化钠、50mmedta-2na(ph=8)、5%的吐温20（v/v）、sls十二烷基肌氨酸钠0.5%（m/v）、100mm的nacl；

8、结合液：异丙醇；

9、磁珠：硅羟基磁珠，浓度为50mg/ml，用量为30μl，磁珠的粒径为300nm;

10、carrier rna：每反应，向裂解液中加入8μg的carrier rna，震荡混匀后作为裂解液工作液；这里的carrier rna为“翌圣生物科技上海有限公司”的商品，货号：19704es01。

11、漂洗液1，所述漂洗液1包括1 m异硫氰酸胍或盐酸胍、50mm tris-hcl（ph=8）、5%的吐温20（v/v）（此吐温20的作用是减小漂洗过程中磁珠的聚集成团，并粘1.5ml离心管管壁的现象）；

12、漂洗液2，所述漂洗液2为80%的乙醇（v/v）；

13、洗脱液，所述洗脱液为depc水。

14、本发明另一方面还提供了一种dna和rna同提取的手动提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

15、1）制备裂解工作液总体系：按照提取350μl的样本量，需加入396μl的裂解液和132μl的结合液，以及rna助沉剂混匀，得到裂解工作液总体系， 优选地，rna助沉剂为carrierrna，用量为3-12μg，在本发明的一个优选实施例中，用量为8μg。在本发明的具体实施例中，配置裂解工作液总体系还要计算冗余：比如共提取5个样本，需加入396×5.03，即1992μl的裂解液，132×5.03μl，即665μl的异丙醇，以及40μl的carrier rna(1μg/μl，carrier rna不需要计算冗余)；

16、2）向离心管中依次加入10μl蛋白酶k（40mg/ml）、350μl样本、525μl步骤1）制备的裂解工作液，震荡混匀，短离，于金属浴上65-75℃、800rpm，裂解10-15min，其中短离是指使用掌上离心机，离心5s以内，目的是把管壁和管盖上的液体轻轻的离心下来；

17、3）静置5min，待温度降到室温，加入30μl磁珠，震荡混合均匀，室温放置10min，期间不时颠倒混匀，使磁珠保持悬浮状态。短离，放置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；

18、4）第一次漂洗：继续加入500μl漂洗液1，震荡混合均匀30s，短离，放置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；

19、5）第二次漂洗：继续加入500μl漂洗液2，震荡混合均匀30s，短离，放置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；

20、6）第三次漂洗：重复步骤5）一次；

21、7）晾干：短离上一步的离心管，静置，吸弃残余的液体，并敞开盖子，空气干燥7-10min;

22、8）洗脱：加入50-100μl洗脱液，用移液枪吹吸混匀，于金属浴上，1600rpm，50-60℃孵育10min。短离，将管盖上的蒸发的液体离心下来。最后，放置于磁力架上，静置后吸取上清，即得到含有病毒dna、rna的上清液，优选地洗脱温度为56℃。在本发明的实施例中，所述样本包括无细胞体液，优选地，所述样本选自血清、血浆、组织研磨液的离心上清中的至少一种。

23、本技术的有益效果包括但不限于：

24、1、通过carrier rna的运用，使得灵敏度得到提高。本试剂盒通过对比不同量的carrier rna提取效果，发现每份样本添加8μg时，病毒检测的ct值最小；

25、2、通过优化裂解液中各组分的搭配、各组分的最适浓度，使病毒核酸得到最大程度释放；

26、3、通过优化裂解液和异丙醇的比例、磁珠的用量，使磁珠和病毒核酸的结合达到最大化；

27、4、由于于磁珠优先吸附大核酸片段，因此，对于较小的病毒，其核酸长度较短，不易于被磁珠吸附。针对此问题，我们选择猪圆环病毒（病毒粒子最小的一种病毒）作为研究对象，结果证明我们的试剂盒在检测小病毒时灵敏度很好，与竞品相较，性能更优；

28、5、在检测较大的病毒时，如猪蓝耳病毒，灵敏度也很好，和市场上优秀的产品相比较，灵敏度更优；

29、6.本发明的方法在提取核酸时可直接提取dna和rna，不需要额外区分核酸的类型，并根据核酸类型采取不同的实验步骤，操作更加简单。