抗人CD19的单链抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种抗人cd19的单链抗体及其应用。

背景技术：

1、自身免疫性疾病是指免疫系统错误地攻击和破坏自身组织和器官，导致身体产生自身免疫反应。b细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它们可以通过产生抗体来帮助身体抵抗病原体和异物。然而，在自身免疫性疾病中，b细胞会错误地攻击身体自身的组织和器官。b细胞主要通过以下机制影响自身免疫性疾病：a.产生自身抗体：b细胞可以产生针对自身组织和器官的抗体，这些抗体可以导致自身免疫反应。例如，在1型糖尿病中，b细胞产生胰岛细胞抗体，攻击和破坏胰岛细胞，导致血糖水平异常升高。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus），患者体内存在多种针对自身细胞核成分的抗体，如抗双链 dna 抗体、抗 sm 抗体等。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis）：产生类风湿因子（rf）、抗环瓜氨酸肽抗体（anti-ccp）等自身抗体。b.激活其他免疫细胞：b细胞可以激活其他免疫细胞，如巨噬细胞和t细胞，从而促进自身免疫反应。例如，在系统性红斑狼疮中，b细胞可以激活t细胞，导致免疫系统攻击身体的多种组织和器官。c.促进炎症反应：b细胞可以分泌炎症因子，促进炎症反应，加剧自身免疫反应。例如，在关节炎中，b细胞可以产生促炎因子，引起关节炎症状。d.作为抗原提呈细胞：例如，多发性硬化症（multiplesclerosis），b细胞提呈自身抗原激活 t 细胞，导致神经髓鞘损伤。重症肌无力（myasthenia gravis），b细胞提呈乙酰胆碱受体相关抗原，引发自身免疫反应。

2、b 细胞作为人体免疫系统的主要构成之一，主要通过分泌抗体参与免疫反应，还可与 t 细胞相互作用，释放细胞因子参与自身免疫的发生与发展，目前已证实 b 细胞及其效应物（如抗体和细胞因子）参与多个自身免疫性疾病的发生与发展。因此，清除 b 细胞、抑制异常的免疫反应，成为治疗自身免疫疾病的新策略，具有临床意义和必要性。

3、目前b 细胞清除疗法（bcdt）主要有：a. 利用抗体药物靶向结合 b 细胞特异性抗原（b 细胞的特异表面分子主要有cd34、cd38、cd10、igh、cd19、cd20、cd21、cd22 和 cd23等），通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（adcc）或补体依赖的细胞毒性作用（cdc）介导b 细胞裂解；b. 通过靶向结合 b 细胞存活需要的细胞因子，如 b 细胞激活因子（baff），从而诱导 b 细胞凋亡。

4、依据靶向清除与非靶向清除，可分为：靶向药物（靶向cd20、靶向cd19（含car-t疗法）、靶向 b 细胞活化因子（baff）等）；体外血浆置换、免疫抑制剂。其中靶向cd20可细分为：单抗、双抗；靶向cd19 细分为单抗、双抗、adc疗法、car-t疗法。

5、cd19是一种b细胞表面的95kpa的糖蛋白，从b细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。cd19是免疫球蛋白（ig）超家族的成员之一，作为b细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了b细胞受体的信号转导过程。在cd19缺陷的小鼠模型中，外盾淋巴组织中b细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清ig水平的减低。通常认为，cd19的表达只限于b细胞系（b-cell 1ineage），而不表达于多能造血干细胞表面。cd19还表达于大多数b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、alls、clls、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中。cd19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，cd19不会表达于除b细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使cd19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗cd19的抗体或scfv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。近年来cd19cart细胞领域竞争激烈，一些大的制药公司也和研究机构建立了合作关系。接受表达cd28或4-1bb的cd19car t细胞治疗后，小儿和成人复发或难治性急性b细胞淋巴瘤具有大约90%的完全缓解率。但是car-t细胞疗法操作繁琐，car-t细胞在给药前需要用氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴细胞耗竭化疗。而且car-t细胞更高的疗效伴随着毒性，car-t细胞疗法中的t细胞具有内在的功能活性，导致其毒性更加复杂和严重，例如可致命的细胞因子释放综合征（crs）。

6、血液吸附治疗是基于孔吸附，和/或疏水作用，和/或静电吸附，和/或生物亲和（补体结合，fc段结合和抗原-抗体结合）原理，通过体外循技术，广谱性、选择性或特异性地吸附血液中的致病因子，又不至于影响机体正常功能，从而达到净化血液，缓解病情的目的。

7、临床中常用的血液净化技术包括血液灌流、血液滤过、血液透析等，目前血液净化已成为继手术、药物之后的第三种治疗方式，成功应用于自身免疫性疾病的治疗以及肝衰竭、肾衰竭、药物中毒的治疗。近年来，血液净化也被广泛应用于炎症因子、脓毒症、重症胰腺炎的治疗。

8、在血液净化治疗免疫性疾病方面，康碧尔蛋白a免疫吸附柱，将一位患罕见重症“视神经脊髓炎谱系病”10年、双目失明的20岁女孩救治成功。仅用时18天，患者便康复出院。它将免疫类疾病患者的血浆输入吸附柱，让柱子上的基因工程重组葡萄球菌蛋白a分子，快速“抓住”并清除患者血浆中的致病性抗体，再让净化后的血液回输到人体内，如此循环往复，持续清除血液中的致病物质，从而达到救治目的。可广泛应用于治疗肾衰竭尿毒症、系统性红斑狼疮、风免疫病、重症肌无力等神经系统疾病以及器官移植排斥反应等多个领域。

9、因此，将免疫吸附剂与抗体药物组成的复合物也有吸附作用，所以可用于b细胞异常的自身免疫性疾病治疗的辅助治疗方式。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种抗人cd19的单链抗体及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、一种抗人cd19的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区域cdr1～cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1～seq id no.3所示，所述轻链可变区的互补决定区域cdr1～cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.4～seqid no.6所示。

4、在一些单链抗体的实例中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。

5、在一些单链抗体的实例中，其为嵌合抗体、人源化抗体、融合fc片段的抗体。

6、在一些单链抗体的实例中，所述fc片段选自人源igg1、igg2、igg3或igg4的fc段或其变体、改造体。

7、在一些单链抗体的实例中，抗体通过连接序列与其他抗体偶联，形成二价或多价抗体，或形成二聚体或多聚体。

8、本发明的第二个方面，提供：

9、一种核酸分子，编码本发明第一个方面所述的单链抗体。

10、本发明的第三个方面，提供：

11、一种表达载体，包含本发明第二个方面所述的核酸分子。

12、本发明的第四个方面，提供：

13、发明第一个方面所述单链抗体的应用，所述应用包括：

14、制备b细胞免疫吸附剂；

15、制备b细胞检测试剂；

16、制备cd19检测试剂；

17、制备靶向cd19的免疫偶联物；

18、制备治疗b细胞相关疾病的抗体药物。

19、在一些应用的实例中，所述偶联物为药物，所述b细胞相关疾病选自肿瘤及自身免疫性疾病。

20、在一些应用的实例中，肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、胶质母细胞瘤；自身免疫性疾病包括但不限于红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、 特发性炎症性肌炎、系统性硬化症、原发性干燥综合征。

21、在一些应用的实例中，所述免疫偶联物由纳米抗体和连接在纳米抗体上的偶联物构成，如抗体与小分子组成的adc药物。

22、在一些应用的实例中，所述偶联物为药物。

23、本发明的第五个方面，提供：

24、一种免疫吸附剂，包括固相载体，所述固相载体上偶联有本发明第一个方面所述的单链抗体。

25、在一些免疫吸附剂的实例中，所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂、纤维素中的至少一种。

26、本发明的第六个方面，提供：一种血液净化器械，包括本发明第五个方面所述的免疫吸附剂。

27、本发明的有益效果是：

28、本发明一些实例的抗人cd19的单链抗体，可以特异性与人cd19蛋白结合，且结合稳定。

29、本发明一些实例的抗人cd19的单链抗体，可以用于制备cd19蛋白检测试剂、吸附试剂；制备b细胞引起的相关疾病的治疗或辅助治疗。

30、本发明的一些实例，通过将该抗人cd19的单链抗体偶联吸附柱，经过体外血液循环，针对性地吸附血液中的b细胞，能够快速降低致病因子水平，迅速减少循环中异常活化或致病的 b 细胞及其产生的抗体、细胞因子等致病因子，从而快速缓解症状。其次针对性强，可以相对特异性地针对 b 细胞进行清除，减少对其他细胞类型的影响。而且能够为其他治疗争取时间，在疾病急性发作或严重阶段，有助于稳定病情，为后续的免疫调节治疗或其他针对性治疗创造有利条件。不仅如此，还能够改善免疫失衡，调整免疫系统的失衡状态，有助于恢复免疫稳态。最后，可在必要时重复进行，以维持治疗效果，安全性高。