一株假单胞菌TB392及其在烟叶中果胶降解和香味物质生成中的应用的制作方法

本发明涉及一株假单胞菌tb392及其在烟叶中果胶降解和香味物质生成中的应用，属于生物。

背景技术：

1、烟叶发酵又叫烟叶醇化、陈化，其本质过程是一种在一定环境条件下，利用烟叶表面微生物的生长代谢功能将烟叶中诸如果胶、纤维素、蛋白质等大分子化合物降解，同时产生一些能够提升烟叶品质评级的小分子化合物。目前主流的醇化方法一般分为自然醇化和人工醇化。其中自然醇化，一般是将烟叶堆放在一定温湿度的仓库中1～3年，利用烟叶自带的微生物发酵，通常效果较好，但周期长易受滋生杂菌或蚊虫影响，且需要大量的环境稳定的仓库堆放烟草，堆放成本较高；而目前人工醇化常用菌种往往来源于烟草根际土壤或新鲜烟叶表面，而经过烘烤和醇化后的烟叶环境不适合这些微生物生长，因此往往会出现实验效果理想而应用效果较差的情况。

2、纤维素、果胶、蛋白质、淀粉和木质素等大分子是影响烟叶品质的主要因素。其中果胶含量过高，在燃吸过程果胶会产生甲醇，甲醇会进一步氧化形成甲酸、甲醛等，产生较强的刺激性气味，进而影响烟叶的感官品质，另外这些刺激性气味气体也不利于身体健康。因此，降低果胶含量对烟叶品质提升至关重要。使用烟叶表面来源的菌株进行人工醇化，可以最小程度的降低对烟叶表面其它发酵菌活性的影响，进而降低烟叶品质的影响。

3、烟叶中的香味物质主要来源于苯丙氨酸降解、美拉德反应以及类胡萝卜素降解产物。其中，苯丙氨酸转化产物如苯甲醛、苯乙醇、苯甲酸等是重要的致香物质，其中苯甲醛、苯乙醇可作为主体香气使用，增加烟叶中的坚果香、甜香、爆米花香和卷烟烟气的玫瑰香；美拉德反应形成的氨基羰基重排得到的“面包香”或“烘烤香”中间产物，如5-甲基-2-糠醛能增加卷烟烟气的清甜、花香和烤烟本香；类胡萝卜素是烟叶中重要的香气前体物质，其降解产物在很大程度上影响烟叶的香气品质；新植二烯是烤烟中性香味物质中含量最高的成分，可以充当其他物质的载体，减轻烟气对咽喉的直接刺激作用；β-大马酮具有玫瑰特征香气，香叶基丙酮具有青味能增加烟气浓度，巨豆三烯酮能增加烟叶中的花香和木香。

4、针对上述问题，开发一种能够适应烘烤和醇化后烟叶环境的微生物制剂，加速品质评级较差的烟叶醇化进程，缩短醇化周期，这对卷烟厂提高烟叶品质、降低成本具有非常重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一株假单胞菌及其应用。该假单胞菌能够降低复烤烟叶中的果胶、蛋白质、淀粉、纤维素、木质素以及类胡萝卜素等大分子化合物的含量，同时提高烟叶中香味物质含量，产生新的香味物质，显著提高复烤烟叶的感官品质和评吸品级。

2、本发明技术方案如下：

3、本发明的第一个目的是提供一株假单胞菌(pseudomonas sp.)tb392，所述假单胞菌tb392已于2024年10月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.32230。

4、在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌tb392分离自陕西宝鸡2022年的c3f-ab烟叶中，其16s rdna核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、在本发明的一种实施方式中，假单胞菌tb392具有以下生物学特征：

6、(1)菌体特征：为革兰氏阴性菌，呈细杆状，有鞭毛；

7、(2)菌落特征：圆形单菌落，白色，中心稍隆起；

8、(3)生长特性：假单胞菌tb392菌株生长温度范围为25～35℃，生长ph范围为6.0～8.0；

9、(4)属于兼性需氧菌，在无氧条件下生长缓慢；

10、(5)可高产果胶酶，具有降低烟叶中果胶的能力，可降低果胶降解产物甲酸和乙酸含量；

11、(6)具有降解β-胡萝卜素、叶黄素的能力，降解率分别达到69.704％和51.497％；

12、(7)具有降低烟叶中蛋白质、淀粉、木质素和纤维素的能力；

13、(8)具有降低烟碱的能力，对1g/l浓度烟碱的降解率为70.49％；

14、(9)具有降低烟叶中类胡萝卜素的能力，可提高烟叶中类胡萝卜素降解产物β-环柠檬醛、巨豆三烯酮、新植二烯、β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮等香味物质的含量；

15、(10)提高烟叶中苯丙氨酸的代谢产物如苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸的含量；

16、(11)提高烟叶中美拉德反应产物的含量，例如提高吲哚、呋喃基羟甲基酮、5-羟甲基-2(5h)呋喃酮、呋喃基羟甲基酮、2-羟基丁内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-乙酰吡咯、糠醛、糠醇、5-甲基糠醛等香气物质的含量；

17、(12)改善烟叶吸食品质。

18、本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，含有本发明的假单胞菌tb392。

19、在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂以假单胞菌tb392为主要微生物。

20、在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中，假单胞菌tb392的细胞浓度不低于3.0×108cfu/ml。

21、在本发明的一种实施方式中，所述菌剂，是制备假单胞菌tb392的种子液，然后扩培得到的。

22、在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有本发明的假单胞菌tb392菌株的菌体活细胞、冷冻干燥得到的本发明的假单胞菌tb392的干菌体、固定化的本发明的假单胞菌tb392的细胞、本发明的假单胞菌tb392的液体菌剂、本发明的假单胞菌tb392的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的本发明的假单胞菌tb392菌株。

23、在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂通过以下步骤制备而成：

24、(1)将假单胞菌tb392菌种，接种至lb液体培养基进行活化培养，制备成种子液；

25、(2)种子液进一步经过发酵培养；结束后，离心去除上清，加水制备成菌悬液；

26、(3)将发酵液离心，弃上清，然后加水重悬，并调整菌浓度，得到含有假单胞菌tb392的微生物制剂。

27、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述培养条件为：25～35℃、100～250rpm条件下培养16～24h。

28、在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述培养条件为：25～35℃、100～250rpm条件下培养16～24h至od达到3～5。

29、在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述离心条件为4℃、6000rpm离心15min。

30、本发明的第三个目的是提供一种提升烟叶品质的方法，所述方法利用假单胞菌tb392或其微生物制剂发酵烟叶来提升烟叶品质。

31、在本发明的一种实施方式中，所述提升烟叶品质为：降低烟叶中的烟碱、降低烟叶大分子化合物含量和/或提高烟叶中香味物质含量。

32、在本发明的一种实施方式中，所述烟叶大分子化合物为蛋白质、淀粉、果胶、木质素、纤维素、类胡萝卜素。

33、在本发明的一种实施方式中，所述烟叶中香味物质包括但不限于β-环柠檬醛、巨豆三烯酮、新植二烯、β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸、吲哚、呋喃基羟甲基酮、5-羟甲基-2(5h)呋喃酮、呋喃基羟甲基酮、2-羟基丁内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-乙酰吡咯、糠醛、糠醇、5-甲基糠醛。

34、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

35、(1)将假单胞菌tb392菌悬液均匀喷洒到烟叶表面，置于恒温恒湿箱中发酵；

36、(2)将发酵好的烟叶烘干，获得发酵烟叶。

37、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述菌悬液浓度为(1～5)×108cfu/ml，添加量为0.05～0.5ml/g烟叶；

38、优选地，所述菌悬液浓度为3×108cfu/ml，添加量为0.1ml/g烟叶。

39、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述发酵温度为25～35℃、湿度为60～80％，发酵时间为12～48h；

40、优选地，所述发酵时间为24h。

41、在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述烘干温度为45～55℃；所述发酵烟叶含水量为1.0％～1.2％；

42、优选地，所述烘干温度为50℃，所述含水量为1.2％。

43、本发明的第四个目的是提供一种降解类胡萝卜素或降解烟叶中类胡萝卜素的方法，所述方法利用假单胞菌tb392或其微生物制剂降解类胡萝卜素。

44、在本发明的一种实施方式中，所述类胡萝卜素包括β-胡萝卜素、叶黄素。

45、本发明的第五个目的是提供假单胞菌tb392或其微生物制剂在提高烟叶中类胡萝卜素降解产物含量、提高烟叶中苯丙氨酸的代谢产物含量或提高烟叶中美拉德反应产物含量中的应用。

46、在本发明的一种实施方式中，所述类胡萝卜素降解产物包括β-环柠檬醛、巨豆三烯酮、新植二烯、β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮。

47、在本发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸的代谢产物包括苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸。

48、在本发明的一种实施方式中，所述美拉德反应产物包括吲哚、呋喃基羟甲基酮、5-羟甲基-2(5h)呋喃酮、呋喃基羟甲基酮、2-羟基丁内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-乙酰吡咯、糠醛、糠醇、5-甲基糠醛。

49、本发明的第六个目的是提供一种降解烟叶中果胶的方法，所述方法利用假单胞菌tb392或其微生物制剂降解果胶。

50、本发明的第七个目的是提供所述假单胞菌tb392或含有所述假单胞菌tb392的微生物菌剂在制备烟草制品中的应用。

51、在本发明的一种实施方式中，所述的烟草制品为烟用香料、烟草浸膏、烤烟烟叶或雪茄烟叶等。

52、生物材料保藏

53、假单胞菌pseudomonas sp.tb392，分类学命名为：假单胞菌pseudomonas sp.，已于2024年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.32230，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

54、有益效果：

55、(1)本发明筛选获得并保藏的假单胞菌tb392可高产果胶酶，具有降解烟叶中果胶、蛋白质、淀粉、纤维素、木质素和类胡萝卜素等大分子能力，具体数据而言，果胶降解率达72.09％，纤维素降解率15.78％，类胡萝卜素降解率达36.6％；且可降低烟叶中果胶降解产物甲酸和乙酸含量；

56、(2)本发明提供的假单胞菌tb392具有降解β-胡萝卜素、叶黄素的能力，降解率分别达到69.704％和51.497％；

57、(3)本发明提供的假单胞菌tb392具有降解烟碱的能力，对1g/l浓度烟碱的降解率为70.49％，能在高达5g/l的烟碱浓度下生长，对5g/l浓度的烟碱降解率为15.4％；

58、(4)本发明提供的假单胞菌tb392具有降低烟叶中类胡萝卜素的能力，提高烟叶中类胡萝卜素降解产物β-环柠檬醛、巨豆三烯酮、新植二烯、β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮等香味物质的含量；

59、(5)本发明提供的假单胞菌tb392可提高烟叶中苯丙氨酸的代谢产物如苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸的含量；

60、(6)本发明提供的假单胞菌tb392可提高烟叶中美拉德反应产物的含量，如吲哚、呋喃基羟甲基酮、5-羟甲基-2(5h)呋喃酮、呋喃基羟甲基酮、2-羟基丁内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-乙酰吡咯、糠醛、糠醇、5-甲基糠醛等香味物质的含量；

61、(7)经本发明提供的假单胞菌tb392发酵后的烟叶香味物质含量明显提升，明显提升烟叶的香气质、香气量，杂气和刺激性降低；

62、(8)采用本发明提供的假单胞菌tb392进行烟叶发酵应用时，发酵时间大大缩短，仅需24h就能达到理想的评吸标准，极大提高生产效率。

63、综上，利用该菌株应用烟叶后，能有效改善烟叶品质，加速烟叶发酵，节约发酵时间，大大提升复烤烟叶尤其是低级次品烟叶的可用性。