乙型肝炎病毒的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用的制作方法

本发明属于医学免疫学和感染病学领域，具体涉及乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)感染是最常见感染性疾病之一，严重危及人类的健康。抗病毒治疗是目前乙肝的最根本疗法，对大多数患者非常有效，主要包括核苷(酸)类似物和干扰素治疗。但是由于hbv在受感染细胞核中形成共价闭合环状dna(cccdna)和整合序列而长期存在，目前的标准疗法只能抑制病毒复制，不能彻底清除hbv，hbsag也经常不能转阴，停药后hbv易再激活。乙肝的慢性转化和停药后复发是我们现在面临的严峻问题。

2、hbv基因组由不完全双链环状dna组成，长的为负链，含3020-3320个碱基，短的为正链，含1700-2800个碱基。包括四个开放阅读框(orf)，分别称为c、x、p和s编码区。c区由pre-c和c基因组成，分别由不同的起始密码子调控，在相同的终止密码子处结束，pre-c和c基因共同编码pre-c蛋白，pre-c蛋白再经过切割加工后形成e抗原(hbeag)。c基因编码病毒的衣壳蛋白，即hbcag。s区由s基因、pres1和pres2基因组成，由3个不同的起始密码子启动翻译，在同一个终止密码子处终止翻译，分别编码表面抗原(hbsag)蛋白、pres1蛋白和pres2蛋白。p区基因编码的hbv的聚合酶蛋白(hbpol)。x区的基因编码x蛋白(hbx)，包含154个氨基酸，是最小的一个开放阅读框。

3、细胞毒性t细胞(cytotoxic t lymphocyte,ctl)是介导适应性免疫应答的核心细胞，在抗感染、抗肿瘤以及超敏反应和自身免疫病的发生中起着至关重要的作用，其细胞膜上的t细胞受体(t cell receptor,tcr)能够特异性识别并结合抗原递呈细胞表面mhc i类分子与抗原肽的复合物，即mhc/抗原肽复合体分子。ctl表位是指与mhc i类分子结合的抗原肽，是抗原分子中能被tcr特异性识别的线性片段或空间构象性结构，是引起免疫应答反应的基本抗原单位，在ctl活化过程中扮演着关键角色。

4、mhc系统指主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,mhc)，是脊椎动物基因组中一组紧密连锁的基因群，编码表达mhc i类和ii类蛋白分子。hla(human leukocyte antigen)是人类的mhc系统，是人体最复杂的基因群，在人群中具有高度多态性。hla在抗原识别、抗原呈递等机体免疫过程中发挥重要作用，是影响人体免疫反应的主要因素。hla i类分子主要负责将内源性hbv抗原呈递给cd8+ctl，活化的ctls通过分泌穿孔素和颗粒酶等使病毒感染的肝细胞凋亡，同时分泌特定的细胞因子抑制hbv的复制。因此，动态监测hbv抗原特异性cd8+t细胞的数量和功能可以准确反映乙肝感染者针对hbv的特异性免疫功能状态。由于不同人的hla分子型别不同，其对hbv不同抗原的加工、处理和提呈能力也不相同，从而引起不同程度的hbv抗原特异性免疫应答反应。根据乙肝患者不同的hla分子型别，选择其所提呈的hbv特异性抗原肽，动态监测该hbv抗原肽特异性的cd8+t细胞的数量和功能，对hbv感染者的疾病进程监测、诊断与治疗方案的制定、疗效观察和预后转归的判断等都有重要意义，是实现乙肝精准医学治疗的重要技术手段。同时，利用这些hla-b分子高亲和力结合的hbv特异性抗原肽，还可以制备多肽疫苗或基因疫苗，预防和治疗hbv感染。

5、但是，目前已明确的被各种hla分子所提呈并能刺激机体引起t细胞应答反应的hbv抗原肽仍然很少，从而限制了对携带不同hla等位基因的乙肝患者开展特异性t细胞检测，也限制了hbv特异性t细胞在乙肝发生发展中的作用研究，更限制了基于hla基因个体差异性及其提呈的hbv抗原肽差异性的个性化检测和精准免疫治疗。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提出了乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，涉及乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为如下序列中的任一种或多种：

4、eeirlmvfvl；

5、fssagpcal；

6、ksvqhlesl；

7、rvtggvflv；

8、上述氨基酸序列单个氨基酸的去除或者更换后的氨基酸序列。

9、本发明的第二方面，涉及上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽在制备乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗中的应用。

10、本发明的第三方面，涉及上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽的核酸分子。

11、本发明的第四方面，涉及一种核酸分子的载体。

12、本发明的第五方面，涉及一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒的疫苗，含有上述的核酸分子或上述的载体。

13、本发明的第六方面，涉及上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽在制备用于治疗和预防乙型肝炎的药物中的应用。

14、本发明的第七方面，涉及上述所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽在制备检测乙型肝炎病毒抗原特异性t细胞的试剂盒中的应用。

15、可选地，所述试剂盒包括：酶联免疫斑点法试剂、胞内细胞因子荧光染色法试剂、酶联免疫吸附试验试剂、人类白细胞抗原多聚体荧光染色或流式细胞分析法试剂。

16、本发明的第八方面，涉及一种单克隆抗体，能够特异性结合上述的表位肽。

17、本发明的第九方面，涉及一种用于治疗乙型肝炎的药物，包括上述的单克隆抗体。

18、更具体地说，本发明提供了新的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽，其氨基酸序列为如下所示表位肽序列中的任一种：

19、

20、

21、由上述的表格可看出，上述序列分别为乙肝病毒聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)的抗原肽序列，分别与hla-b1302，b4001，b5101,b1501，b4801，b5801分子呈高亲和力结合，在抗原提呈细胞表面组成mhc/抗原肽复合体分子，与抗原肽特异性cd8+t细胞克隆结合，刺激其活化、增殖和分化，发挥抗乙型肝炎病毒的免疫效应作用。

22、所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗：多肽疫苗制备：按照本发明的抗原表位肽序列人工合成一种或多种抗原肽，与佐剂混合制成可溶性制剂，或者由生物纳米材料装载制成纳米多肽疫苗，注入乙肝病毒感染者或乙型肝炎患者体内，激发患者乙肝病毒抗原特异性t细胞活化、增殖，并增强其杀瘤细胞活性，从而制备成乙肝多肽疫苗。基因疫苗制备：按照本发明的多肽序列，构建一种多肽或多种多肽的重组dna基因片段、重组质粒或者重组病毒载体，注入乙肝病毒感染者或乙型肝炎患者体内，使该重组基因在体内表达一种或多种多肽，激发乙肝病毒抗原特异性t细胞活化、增殖，并增强其杀病毒感染细胞的活性，从而制备成乙肝基因疫苗。

23、所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备检测乙型肝炎病毒抗原特异性t细胞的检测制剂或试剂盒：按照本发明的抗原表位肽序列，人工合成一种或多种抗原肽，在酶联免疫斑点法、胞内细胞因子荧光染色法和酶联免疫吸附试验中，作为抗原制剂，与患者外周血单个核细胞(pbmc)混合培养，刺激乙肝病毒抗原特异性t细胞活化、增殖和分泌细胞因子，进而通过其他组合试剂检测该细胞因子的合成量，从而反应特异性t细胞的数量和反应活性；也可以利用这些多肽通过基因工程技术和蛋白工程技术制备人类白细胞抗原与多肽的复合体(peptide-hla complex)及其多聚体，再进一步制备成荧光素标记的制剂，用流式细胞分析法检测患者外周血pbmc细胞群中乙肝病毒抗原特异性t细胞的数量。相关试剂盒则是指由上述制剂与不同检测方法中常用的其他试剂组装而成的乙肝病毒抗原特异性t细胞检测试剂盒。

24、所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备治疗乙型肝炎的药物：将上述基于本发明抗原表位肽序列的多肽疫苗或基因疫苗与其他免疫治疗制剂或化学治疗制剂组合，制备成治疗乙肝的临床药物。

25、本发明利用六种在线表位预测数据库虚拟预测hla-b分子限制性的hbv特异性抗原表位肽序列，获得一组能分别与hla-b4601,b4001,b5801,b1502,b5101,b1301,b1302,b1501,b4006,b5401,b3501,b5201,b0702,b4403,b4801分子呈高亲和力结合的hbv特异性抗原表位肽序列，然后通过胞内细胞染色实验验证了其免疫原性，为制备hbv感染的治疗和预防性疫苗以及研制hbv抗原特异性t细胞检测试剂等提供了特异性抗原肽。

26、1.选择乙肝病毒聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)氨基酸序列为靶向序列；

27、2.选择预测结果获得研究者公认的、具有较高准确性的、常用的六种表位预测数据库：syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen预测上述15种hla-b分子限制性的hbv特异性抗原表位肽序列；

28、3.根据一定的预测标准，对六个在线表位预测网站的预测结果进行整合分析，获得六个网站预测结果较一致的候选抗原肽序列。

29、4.通过ifn-γics细胞功能性实验验证hbv抗原表位肽的免疫原性。

30、5.通过表达特定hla-b分子的hmy2.cir细胞株进行hla-b分子的多肽竞争结合实验，分析阳性表位肽与特定hla-b分子结合力。

31、6.通过接种c57bl/6j小鼠验证阳性表位肽在体内刺激特异性t细胞活化增值的免疫原性。

32、本发明为乙肝病毒聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)中能分别与hla-b1302，b4001，b5101,b1501，b4801，b5801分子呈高亲和力结合并且具有免疫原性的抗原肽序列；还涉及到以上述抗原肽为基础的乙型肝炎多肽疫苗、基因疫苗、乙型肝炎的治疗与预防方法，以及以上述抗原肽为基础的检测乙型肝炎病毒抗原特异性t细胞的试剂和方法。

33、相对于现有技术，本发明的优点如下，

34、经在线虚拟预测和功能性实验验证获得的hla-b1302，b4001，b5101,b1501，b4801，b5801分子限制性的hbv特异性抗原表位肽以前没有被报道过。这些hla-b分子以前也没有被报道有限制性的hbv抗原肽。因此这些新的抗原表位肽序列将为研制针对乙型肝炎治疗性和预防性多肽疫苗和基因疫苗、设计检测乙型肝炎病毒抗原特异性t细胞的试剂和方法等提供所需的关键抗原组分，即抗原表位肽序列；同时这些抗原表位肽也为针对这些特定hla-b等位基因的乙型肝炎患者进行个体化检测和精准医疗提供了关键的抗原组分。