一种病毒样质粒及其应用的制作方法

本发明涉及病毒样质粒培养及细胞制备领域，尤其涉及一种病毒样质粒，及其该病毒样质粒构建病毒样颗粒后应用于体外扩增培养nk细胞。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(nk)属于先天免疫系统的一部分，不同于人体的t细胞、b细胞；因其细胞毒性强、无需抗原致敏即可杀伤靶细胞，无主要组织相容性复合体(mhc)限制性，应答速度快等优点而得到广泛的重视；且大量临床实验数据表明，nk细胞对骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌和乳腺癌等癌症具有靶向性；这些优点使其成为治疗慢性或耐药癌症的新选择。

2、以nk细胞为基础的过继性免疫治疗是一种细胞生物治疗方法，通过向肿瘤患者回输经体外诱导培养的nk细胞，使其在机体中发挥直接或间接杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。人体内nk细胞由造血干细胞分化发育而来，主要分布于外周血中，占外周血单个核细胞(pbmc)的5～10％，而回输到体内的nk细胞不会再增殖，因此需要向患者回输大量的nk细胞，才能达到相对较好的治疗效果。

3、目前，如何在体外获得大量高纯度、高活性的nk细胞，一直是nk细胞在临床上大规模应用得首要前提。

4、现有报道关于体外扩增nk细胞的两种主要方法是：纯因子细胞培养法和滋养细胞法。纯因子法以其安全性高而著称，所使用的细胞因子，都是体内环境原本就存在的，通过添加各种细胞因子来刺激单个核细胞，向nk细胞方向诱导，但存在扩增倍数低、扩增得到的nk细胞纯度低活性差、且不同批次间重复性差等问题，很难实现真正的nk细胞活化与增殖；滋养细胞法则是通过添加滋养细胞使外周血中的nk细胞得到定向激活和大量扩增，但在添加的滋养细胞属于癌细胞系，在nk细胞回输治疗中可能存在致癌的风险。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种病毒样质粒，由该质粒构建病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)后，再使用vlps激活nk细胞的体外扩增培养；由于vlps是通过包装过表达mil-21和4-1bbl的细胞系293t而获得，再进行收集纯化后添加至nk细胞培养中，降低了nk细胞使用的安全风险，且nk细胞的获得高效扩增、细胞纯度也大幅度提高。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种病毒样质粒，其为慢病毒质粒中插入有mil-21和4-1bbl编码基因；其中，mil-21和4-1bbl编码基因的氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

4、本发明还提供一种病毒样质粒的制备方法，步骤如下：

5、将il-21与cd8a跨膜区连接，得到嵌合基因mil-21；

6、通过剪切肽与4-1bbl连接，得到嵌合基因4-1bbl；

7、将嵌合基因mil-21及嵌合基因4-1bbl构建到同一个慢病毒样质粒。

8、本发明还提供一种含mil-21和4-1bbl的293t细胞的制备方法包括如下步骤：

9、获取上述病毒样质粒；

10、将所述病毒样质粒、包装质粒pmd-gag/po l、pmd-rev及辅助质粒pmd-vsvg及转染剂加入293t细胞溶液中培养，收集培养液中的上清液离心，得离心上清液并经过滤、浓缩处理，获得慢病毒浓缩液；

11、将293t细胞、dmem完全培养基及所述慢病毒浓缩液混合培养，获得含mi l-21和4-1bbl的293t细胞。

12、一实施例，所述293t细胞的制备方法中，所述病毒浓缩液的制备，具体包括如下步骤；

13、将表达mi l-21和4-1bbl的病毒样质粒、包装质粒pmd-gag/po l、pmd-rev，辅助质粒pmd-vsvg按4:3:2:1的质量比计算后混合，得到质粒混合液；

14、按照质量与体积1:2的比例,将所述质粒混合液与转染试剂pe i加入293t细胞液中，通过转染剂将四质粒转入293t细胞中，于37℃，5％co2培养箱培养，并分别在培养到24小时和48小时，两次收集细胞培养液的上清液；

15、将两次收集的上清液混合后3800rpm离心5min，收集离心上清液用0.45μm滤膜过滤后，转移至超滤管浓缩，即可得到慢病毒浓缩液。

16、一实施例，所述293t细胞的制备方法中，制备含mi l-21和4-1bbl的293t细胞，具体步骤如下：

17、将293t细胞用dmem完全培养基重悬，控制细胞密度为1×105个/ml，并将293t细胞悬液按照每孔加入1ml的量，接种在24孔板的2个孔中，置于37℃，5％co2培养箱培养24h；

18、24h后，将24孔板上接种细胞的2个孔中的dmem完全培养基吸弃，分别加入300μldmem基础培养基，于37℃，5％co2培养箱孵育1h；

19、1h后，按照moi＝5，向24孔板上接种细胞的2个孔中的1个孔中加入所述慢病毒浓缩液，孵育培养6h；

20、6h后，往24孔板上接种细胞的2个孔中分别补加dmem完全培养基至1ml，继续培养36h；

21、36h后，往24孔板上接种细胞的2个孔中分别添加1ug嘌呤霉素，进行细胞筛选培养；挑选高表达mil-21和4-1bbl的单克隆扩大培养后，获得含mil-21和4-1bbl的293t细胞。

22、本发明还提供病毒样颗粒的制备方法，其步骤如下：

23、获取上述制备得到的含mil-21和4-1bbl的293t细胞与包装质粒pmd-gag/po l混合培养，收集培养液的上清液；

24、将收集的上清液3800rpm离心5min，收集离心上清液用0.45μm滤膜过滤后，转移至超滤管浓缩，获得病毒样颗粒。

25、本发明还提供使用病毒样颗粒激活nk细胞的体外扩增培养方法，包括如下步骤：

26、第0天，用20ml nk细胞扩增培养基重悬nk细胞并控制细胞密度为1.0～2.0×106个/ml；将nk细胞悬液接种至包被过的培养瓶中，并加入20～2000μg上述制得的所述病毒样颗粒，于37℃，5％co2培养箱培养；

27、培养第3天至第18天，每隔2～3天补加nk细胞扩增培养基一次，并控制补液后细胞密度为0.8～1.5×106个/ml，直至第18天，培养结束，收集培养得到的nk细胞；其中，在第3天、第5天分别需要补充添加20～2000μg、40～4000μg上述制得的所述病毒样颗粒。

28、一实施例，上述nk细胞的体外扩增培养方法中，包被所述培养瓶中的包被液组分为：终浓度0.5～10μg/ml抗cd20抗体、终浓度0.5～10μg/ml抗cd137抗体以及5～20ml dpbs溶液。

29、一实施例，上述nk细胞的体外扩增培养方法中，所述nk细胞扩增培养基包括kbm581培养基，在该kbm581培养基中含终浓度为100～2000iu/ml的il-2、终浓度为10～200μg/ml nicotinamide及终浓度为1～20v/v％的灭活自体血浆。

30、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

31、(1)、nk细胞体外培养中，vlps的加入，增加了vlps对nk细胞的协同刺激，使得培养得到的nk细胞纯度、增殖情况、活性都更优，在培养到第18天，nk细胞扩增倍数可达1850倍、nk细胞cd3-c56+纯度高达92％左右，且不同来源的nk种子细胞的试验重复性好，避免了纯因子法培养nk细胞时出现的增殖能力差、纯度低等问题缺陷；

32、(2)、nk细胞体外培养中，相比较于滋养细胞法，减少了滋养细胞(肿瘤细胞)直接添加带来的生物安全风险；

33、(3)、添加vlps培养获得的nk细胞，具有高的肿瘤杀伤活性，在效靶比为2:1时，杀伤率可达到80％以上。