检测结核耐药基因的组合物、试剂盒及用途的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及结核耐药基因的检测，更具体地，涉及异烟肼耐药、利福平耐药，以及结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的检测。

背景技术：

1、结核病(tb)是主要由结核分枝杆菌(mtb)感染引起的一种危害人类健康的慢性传染病，是我国面临的重要公共卫生问题之一。tb通过空气传播，症状包括持续咳嗽、发热、盗汗、体重减轻、胸痛和咳血等。tb的治疗通常需要长期使用多种抗生素，包括异烟肼(inh)、利福平(rif)、吡嗪酰胺(pza)和乙胺丁醇(emb)等，而tb耐药基于其病程长，治疗复杂和费用高等特点，一直是临床治疗面临的主要问题。鉴于监测和治疗的需求，世界卫生组织将耐药结核病分为5类：异烟肼耐药结核病(hr-tb)、利福平耐药结核病(rr-tb)、耐多药结核病(mdr-tb)、准广泛耐药结核病(pre-xdr tb)及广泛耐药结核病(xdr-tb)。mdr-tb定义为至少同时对inh和rif耐药，对这两种最有效的一线抗结核药物的耐药性是目前结核病治疗中最令人担忧的问题。

2、病原体的早期诊断并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而通过临床症状和传统的耐药敏感性检测很难快速准确区分mtb和ntm，且无法快速对耐药性做出判断，给临床诊断，用药及病程的治愈均带来了极大的困难。

3、因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述靶标，并且具有良好的灵敏度和特异性，能够准确、高效的在病程早期区分mtb和ntm感染，并为后续利福平，异烟肼用药提供指导。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测结核耐药基因的组合物，包括：

2、第一核酸组合物，所述第一核酸组合物包括检测下列5个靶标中至少4个的上游引物、下游引物及探针：

3、如seq id no:1～3所示的检测inha的上游引物、下游引物及探针；

4、如seq id no:4～6所示的检测katg的上游引物、下游引物及探针；

5、如seq id no:7～9所示的检测aphc-2的上游引物、下游引物及探针；

6、如seq id no:10～12所示的检测rpob-3的上游引物、下游引物及探针；或

7、如seq id no:10～11、13所示的检测rpob-4的上游引物、下游引物及探针。

8、可选地，第一核酸组合物还可以包括：

9、如seq id no:14～16所示的检测fabg1的上游引物、下游引物及探针。

10、本发明提供的联检的组合物，主要利用多色熔解曲线分析技术，通过检测不同靶点，对病原体的耐药性靶点进行检测，从而实现对异烟肼和利福平耐药的检测，以便为后续治疗提供针对性策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到800个菌/ml，特异性好，检测更为准确，为临床医生提供更为准确和全面的结核耐药用药指导，加快对患者实施治疗措施。

11、进一步地，所述第一核酸组合物包括：

12、如seq id no:1～3所示的检测inha的上游引物、下游引物及探针；

13、如seq id no:4～6所示的检测katg的上游引物、下游引物及探针；

14、如seq id no:7～9所示的检测aphc-2的上游引物、下游引物及探针；

15、如seq id no:10～12所示的检测rpob-3的上游引物、下游引物及探针；

16、如seq id no:10～11、13所示的检测rpob-4的上游引物、下游引物及探针；以及

17、如seq id no:14～16所示的检测fabg1的上游引物、下游引物及探针。

18、进一步地，所述组合物还包括第二核酸组合物，用于更为全面的检测结核耐药。

19、更进一步地，所述第二核酸组合物包括：

20、如seq id no:17～19所示的检测ahpc-1的上游引物、下游引物及探针；和/或

21、如seq id no:10～11、20所示的检测rpob-1的上游引物、下游引物及探针；和/或

22、如seq id no:10～11、21所示的检测rpob-2的上游引物、下游引物及探针。

23、可选地，第二核酸组合物还可以包括：

24、如seq id no:14～16所示的检测fabg1的上游引物、下游引物及探针。

25、通过上述核酸组合物额外包括的引物和探针组，本发明提供的联检组合物还能够提供更为全面和准确的结核耐药基因的检测。

26、进一步地，本发明所述组合物还包括第三核酸组合物，用于区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

27、更进一步地，所述第三核酸组合物包括：

28、如seq id no:22～24所示的检测is6110的上游引物、下游引物及探针；

29、如seq id no:25～27所示的检测is1081的上游引物、下游引物及探针；以及

30、如seq id no:28～30所示的检测ntm的上游引物、下游引物及探针。

31、本发明的组合物可同时检测58种耐药突变，具体地，rpob 510-512del；511位点ctg-ccg；513位点caa-cta/cca/aaa/cga；516位点gac-tac/acc/gcc/gtc/ggc；517-518del；522位点tcg-tgg/cag；526位点cac-tac/tgc/gac/ggc/tgc/tcc/cgc/aac/ctc/cag/ctg/caa/agc；531位点tcg-tgg/ttg/ggg/ttc/ccg；fabg1 g609a、g603a；ahpc g-48a、t-44a、t-42c、c-39t、t-34c、g-32a、c-30t、c-15t、c-12t、c-10t、c-10a、c-10g、g-9a、g-6a；inhag-17t、a-16g、c-15t，a-11t、t-8c、t-8a；katg315密码子agc-acc/aac/atc/aca。

32、进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。

33、在一些具体的实施方案中，针对样本添加外源性内标，进一步地，所述内标是枯草芽孢杆菌内标基因。

34、进一步地，本发明组合物的每个核酸组合物内的探针之间的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

35、在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

36、在一些具体的实施方案中，第一核酸组合物中，检测inha的探针的荧光报告基团为fam；检测katg的探针的荧光报告基团为hex；检测rpob-3的探针的荧光报告基团为rox；检测rpob-4的探针的荧光报告基团为cy5；检测fabg1的探针的荧光报告基团为atto425；检测ahpc-2的探针的荧光报告基团为quasar 705。

37、在一些具体的实施方案中，第二核酸组合物中，检测rif-1的探针的荧光报告基团为hex；检测ahpc-1的探针的荧光报告基团为rox；检测rif-2的探针的荧光报告基团为cy5。

38、在一些具体的实施方案中，第三核酸组合物中，检测is6110的探针的荧光报告基团为fam；检测is1081的探针的荧光报告基团为cy5；检测ntm的探针的荧光报告基团为rox。

39、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一组或多组。在本发明中，“组”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

40、本发明的组合物可以任意组合成检测对应12个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中，例如可以检测本发明所提及的12个靶标中任意11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个靶标。这都是本领域技术人员能够预期所得的。

41、举例来说，可以包括上述12组引物和探针中的任意11组，可以包括上述12组引物和探针中的任意10组，也可以包括上述12组引物和探针中的任意9组，也可以包括上述12组引物和探针中的任意8组。

42、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。

43、进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

44、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。

45、在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。

46、在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq2。

47、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

48、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

49、进一步地，本发明的核酸组合物的各成分以混合的形式存在。

50、进一步地，本发明的不同核酸组合物之间以分离的形式存在。

51、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测结核耐药基因的试剂盒中的用途。

52、第三方面，本发明提供了一种检测结核耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

53、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和/或阳性质控品。

54、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水中的至少一种；阳性质控品是fabg1、inha、katg、ahpc、rpob、is6110、is1081、ntm基因的片段质粒混合物。

55、进一步地，所述试剂盒还包括dntp(u)s、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

56、进一步地，所述试剂盒还包括dna聚合酶、尿嘧啶糖基化酶(ung)中的至少一种。

57、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂中的至少一种。

58、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶(ung)、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

59、进一步地，所述dna聚合酶的浓度为5u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。

60、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括taq酶、udg酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。

61、pcr缓冲液的主要成分包括tris-hcl、nacl、nh4cl、tween 20。

62、在一些具体的实施方案中，单个pcr反应管中反应物总体积为20μl～60μl。

63、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。

64、第四方面，提供了一种用于检测结核耐药基因的方法，所述方法包括以下步骤：

65、1)提取待测样本的核酸；

66、2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光pcr检测；

67、3)获得并分析结果。

68、在本发明中，用于检测的样本可以是痰液、肺泡灌洗液、呼吸道分泌物、血液等，但不限于此。

69、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

70、udg酶反应，温度为30～50℃，时间为1～5分钟，1次循环；预变性，温度为90～99℃，时间为0.5～6min，1次循环；变性，温度为90～99℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，延伸，60～80℃,时间为10～30秒，30～50次循环；变性，温度为90～99℃，时间为0.5～6min，1次循环；熔解分析。

71、进一步地，所述检测结核耐药的方法为非诊断目的。

72、在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备检测结核耐药基因的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：

73、1)提取待测样本的核酸；

74、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光pcr检测；

75、3)获得并分析结果。

76、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

77、udg酶反应，温度为30～50℃，时间为1～5分钟，1次循环；预变性，温度为90～99℃，时间为0.5～6min，1次循环；变性，温度为90～99℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，延伸，60～80℃,时间为10～30秒，30～50次循环；变性，温度为90～99℃，时间为0.5～6min，1次循环；熔解分析。

78、在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患感染的信息。例如，该方法可以检测环境、培养物以及饮用水源是否有上述耐药的病原体。