共表达CXCR5和IL-7的嵌合抗原受体双阴性T细胞药物及其用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物及其用途。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell，car-t)疗法，是指通过基因工程手段在体外对t细胞进行改造，将改造后的t细胞回输到患者体内，使其在体内直接识别并结合肿瘤细胞表面的特异性抗原，从而激活t细胞。激活的t细胞通过释放穿孔素、颗粒酶素b等细胞因子直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子招募人体内其他的内源性免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤，从而达到治疗肿瘤的目的。目前car-t细胞疗法已在治疗血液瘤方面取得了良好的疗效，靶向bcma和cd19的car-t疗法于2019年和2021年获得美国食品药品监督管理局批准。然而，由于实体瘤复杂的结构及免疫微环境问题，car-t在治疗实体瘤方面仍面临许多挑战。

2、双阴性t细胞(dnt)是一类cd3+cd4-cd8-的t细胞亚群，仅占人类外周血细胞中t细胞总数的10％左右。dnt高度表达细胞表面受体，例如自然杀伤组2成员d(nkg2d)，以mhc非限制性方式特异性识别并杀死表达相应配体的肿瘤细胞，但不会引起移植物抗宿主病和宿主抗移植物反应，可以实现异体治疗。nkg2d的配体(nkg2dl)在各种肿瘤细胞的表面高表达，但在健康组织中通常低表达或不表达。目前，已经开发出多种基于nkg2d的car-t细胞疗法，并取得了显著的治疗效果。因此，以dnt为基础的car-t细胞治疗是非常有前景的。

3、但是car-t细胞疗法面临的另一个巨大挑战是，肿瘤复杂的免疫微环境导致car-t细胞无法浸润到实体瘤内部，因此无法对肿瘤细胞进行有效杀伤。因此，需要寻找一种改造car-t细胞的方式，增加car-t在体内的扩增效率，并增强其向肿瘤部位迁移的能力。

4、cxc趋化因子受体5(cxcr5)是g蛋白偶联受体家族中的一员，属于cxc趋化因子受体家族。cxcr5主要表达于b细胞、t细胞和树突状细胞表面，在炎症、感染和免疫反应中起着重要作用。cxcl13(chemokine c-x-cmotif ligand 13)又称b细胞趋化因子，是cxcr5的配体。研究表明，cxcl13在多种肿瘤细胞表面异常表达，cxcl3/cxcr5信号轴与肿瘤的迁移和侵袭相关。

5、白细胞介素-7(interleukin-7，il-7)属于il-2细胞因子超家族的一员，是由骨髓基质细胞、胸腺基质细胞、粘膜淋巴样组织及角化细胞分泌的一种糖蛋白。il-7受体主要存在于骨髓细胞谱系和淋巴细胞中，还存在于il-2或有丝分裂原刺激后的nk细胞和t细胞中。il-7必须与il-7受体结合后主要激活细胞内的jak-stat和pi3k-akt两个信号通路，加快细胞周期，提高细胞的生存和增殖能力。

6、因此本发明旨在现有的靶向nkg2dl的car-dnt细胞结构基础上共表达cxcr5和il-7，以达到增强其向肿瘤部位的迁移和浸润能力，并且增加car-t细胞的生存和增殖能力，从而提升car-dnt细胞对肿瘤的杀伤作用，达到治疗肿瘤的目的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物及其用途，以达到增强其向肿瘤部位的迁移和浸润能力，并且增加car-t细胞的生存和增殖能力，从而提升car-dnt细胞对肿瘤的杀伤作用，达到治疗肿瘤的目的。

2、本发明是这样实现的，共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物，所述细胞药物能够共表达cxcr5和il-7，细胞药物包括：依次连接的ef1-α、cd8α信号肽、nkg2d胞外段、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、共刺激分子4-1bb、cd3ζ胞内信号区、t2a、趋化因子受体cxcr5、p2a、白细胞介素il-7；

3、所述cd8α信号肽的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述nkg2d信号肽的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cd8α铰链区的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述cd8α跨膜区的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述共刺激分子4-1bb的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述cd3ζ胞内信号区的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述t2a的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述趋化因子受体cxcr5的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述p2a的核苷酸序列如seq id no.17所示，所述白细胞介素il-7的核苷酸序列如seq id no.19所示。

4、所述cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述nkg2d信号肽的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述cd8α铰链区的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述cd8α跨膜区的氨基酸序列如seq id no.8所示，所述共刺激分子4-1bb的氨基酸序列如seq id no.10所示，所述cd3ζ胞内信号区的氨基酸序列如seq id no.12所示，所述t2a的氨基酸序列如seq id no.14所示，所述趋化因子受体cxcr5的氨基酸序列如seq id no.16所示，所述p2a的氨基酸序列如seq id no.18所示，所述白细胞介素il-7的氨基酸序列如seq id no.20所示。

5、其中，所述cd8α信号肽的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、seq id no.1：

7、atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg

8、所述nkg2d信号肽的核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、seq id no.3：

10、atgttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacatacatctgcatgcaaaggactgtg

11、所述cd8α铰链区的核苷酸序列如seq id no.5所示。

12、seq id no.5：

13、accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcacagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat

14、所述cd8α跨膜区的核苷酸序列如seq id no.7所示。

15、seq id no.7：

16、atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc

17、所述共刺激分子4-1bb的核苷酸序列如seq id no.9所示。

18、seq id no.9：

19、aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaac tactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg

20、所述cd3ζ胞内信号区的核苷酸序列如seq id no.11所示。

21、seq id no.11：

22、agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc

23、所述t2a的核苷酸序列如seq id no.13所示。

24、seq id no.13：

25、gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct

26、所述趋化因子受体cxcr5的核苷酸序列如seq id no.15所示。

27、seq id no.15：

28、atgaactacccgctaacgctggaaatggacctcgagaacctggaggacctgttctgggaactggacagattggacaactataacgacacctccctggtggaaaatcatctctgccctgccacagaggggcccctcatggcctccttcaaggccgtgttcgtgcccgtggcctacagcctcatcttcctcctgggcgtgatcggcaacgtcctggtgctggtgatcctggagcggcaccggcagacacgcagttccacggagaccttcctgttccacctggccgtggccgacctcctgctggtcttcatcttgccctttgccgtggccgagggctctgtgggctgggtcctggggaccttcctctgcaaaactgtgattgccctgcacaaagtcaacttctactgcagcagcctgctcctggcctgcatcgccgtggaccgctacctggccattgtccacgccgtccatgcctaccgccaccgccgcctcctctccatccacatcacctgtgggaccatctggctggtgggcttcctccttgccttgccagagattctcttcgccaaagtcagccaaggccatcacaacaactccctgccacgttgcaccttctcccaagagaaccaagcagaaacgcatgcctggttcacctcccgattcctctaccatgtggcgggattcctgctgcccatgctggtgatgggctggtgctacgtgggggtagtgcacaggttgcgccaggcccagcggcgccctcagcggcagaaggcagtcagggtggccatcctggtgacaagcatcttcttcctctgctggtcaccctaccacatcgtcatcttcctggacaccctggcgaggctgaaggccgtggacaatacctgcaagctgaatggctctctccccgtggccatcaccatgtgtgagttcctgggcctggcccactgctgcctcaaccccatgctctacactttcgccggcgtgaagttccgcagtgacctgtcgcggctcctgacgaagctgggctgtaccggccctgcctccctgtgccagctcttccctagctggcgcaggagcagtctctctgagtcagagaatgccacctctctcaccacgttc

29、所述p2a的核苷酸序列如seq id no.17所示。

30、seq id no.17：

31、gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggtgacgtcgaggagaatcctggtccc

32、所述白细胞介素il-7的核苷酸序列如seq id no.19所示。

33、seq id no.19：

34、atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac

35、在本实施例中，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。

36、seq id no.2：

37、malpvtalllplalllhaarp

38、所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。

39、seq id no.4：

40、mlfnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtv

41、所述铰链区的氨基酸序列如seq id no.6所示。

42、seq id no.6：

43、tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd

44、所述跨膜区的氨基酸序列如seq id no.8所示。

45、seq id no.8：

46、iyiwaplagtcgvlllslvitlyc

47、所述共刺激分子的氨基酸序列如seq id no.10所示。

48、seq id no.10：

49、krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel

50、所述胞内信号区的氨基酸序列如seq id no.12所示。

51、seq id no.12：

52、rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynel qkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

53、所述的氨基酸序列如seq id no.14所示。

54、seq id no.14：

55、egrgslltcgdveenpgp

56、所述趋化因子受体的氨基酸序列如seq id no.16所示。

57、seq id no.16：

58、mnypltlemdlenledlfweldrldnyndtslvenhlcpategplmasfkavfvpvayslifllgvignvlvlvilerhrqtrsstetflfhlavadlllvfilpfavaegsvgwvlgtflcktvialhkvnfycsslllaciavdrylaivhavhayrhrrllsihitcgtiwlvgfllalpeilfakvsqghhnnslprctfsqenqaethawftsrflyhvagfllpmlvmgwcyvgvvhrlrqaqrrpqrqkavrvailvtsifflcwspyhivifldtlarlkavdntcklngslpvaitmceflglahcclnpmlytfagvkfrsdlsrlltklgctgpaslcqlfpswrrsslsesenatslttf

59、所述的氨基酸序列如seq id no.18所示。

60、seq id no.18：

61、atnfsllkqagdveenpgp

62、所述白细胞介素的氨基酸序列如seq id no.20所示。

63、seq id no.20：

64、mfhvsfryifglpplilvllpvassdcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh

65、另一方面，本发明还提供了共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物制备方法，所述共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物制备方法，包括：

66、s10，pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7质粒的构建，获得目的基因homo sapiens c-x-c motif chemokine receptor5(cxcr5)、homo sapiens interleukin7(il-7)的基因序号序列，根据查找获得的cxcr5和il-7的cds序列，设计包含同源臂的引物，以t细胞的cdna为模版，使用pcr的方法获得目的基因片段并进行胶回收，使用限制性内切酶ecori对pll3.7-nkg2d-car载体进行单酶切，并对酶切后的线性载体进行胶回收，使用同源重组酶构建质粒pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7，测序验证质粒构建成功；

67、s20，pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7慢病毒包装；

68、s30，cxcr5/il-7-nkg2d-car-dnt细胞制备。

69、所述pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7慢病毒包装方法，包括：

70、s201，pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7转染；

71、s202，pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7慢病毒收集和浓缩；

72、s203，pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7慢病毒滴度测定。

73、所述cxcr5/il-7-nkg2d-car-dnt细胞制备方法，包括：

74、s301，使用cd4和cd8磁珠对人pbmc进行分选，去除pbmc中的cd4+、cd8+t细胞，在分选后的细胞悬液中加入cd3和cd28抗体激活dnt细胞，48h后对dnt细胞进行离心换液，去除抗体，继续培养6天后，获得dnt细胞，流式检测dnt细胞的比例；

75、s302，将dnt接种于24孔板中，每孔5×105个细胞，共4孔，分别为：无病毒感染阴性对照组、pll3.7-mock阴性对照组、pll3.7-nkg2d-car组和pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7组，按照moi＝10:1加入相应体积的病毒液，24h后将细胞进行收集，400g离心5min，弃去培养基，加入新鲜培养基；

76、s303，慢病毒感染48h后收取细胞，流式检测nkg2d表达效率，即病毒感染阳性率，同时使用流式检测慢病毒感染后的car-dnt的cxcr5的表达量，pll3.7-nkg2d-car-cxcr5-il-7感染的dnt细胞成功过表达cxcr5。

77、s304，收取感染48h后的三组car-dnt细胞，用trizol裂解细胞，抽提总rna，进行逆转录。rt-pcr分析慢病毒感染后的car-dnt细胞的il-7在转录水平上的表达情况。

78、本发明还提供了共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物在制备抗肿瘤药物中的用途，从而提升car-dnt细胞对肿瘤的杀伤作用，达到治疗肿瘤的目的，且可以实现异体治疗。

79、与现有技术相比，本技术实施例主要有以下有益效果：

80、本发明所提供的共表达cxcr5和il-7的嵌合抗原受体双阴性t细胞药物及其用途通过在靶向nkg2dl的car-dnt细胞上共表达cxcr5和il-7，目的在于增强其向肿瘤部位的迁移和浸润能力，并且增加car-t细胞的生存和增殖能力，从而提升car-dnt细胞对肿瘤的杀伤作用，达到治疗肿瘤的目的，且可以实现异体治疗。

81、本发明构建了一种nkg2d-car-dnt细胞，能够靶向高表达nkg2dl的肿瘤细胞，并对其进行杀伤；证明了共表达cxcr5和il-7后，nkg2d-car-dnt细胞向肿瘤的迁移能力增强，同时，在共表达cxcr5和il-7后，nkg2d-car-dnt细胞的抗肿瘤活性显著增强，并通过体外和体内试验进行了验证。