FC-εCAR的制作方法

本发明的领域是重组核酸和包含其的细胞，以产生表达嵌合抗原受体（car）的基因修饰的细胞，尤其是表达具有fcε受体γ（fcεriγ）信号传导结构域的car的修饰的nk和nk-92细胞。

背景技术：

1、自然杀伤（nk）细胞是细胞毒性淋巴细胞，构成先天免疫系统的重要组成部分。在大多数情况下，nk细胞约占循环淋巴细胞的10%-15%，并结合并杀伤靶细胞，该靶细胞包括病毒感染细胞和许多恶性细胞。nk细胞杀伤对特定抗原没有特异性，可以在没有既往免疫敏化的情况下发生。靶向细胞的杀伤通常由细胞溶解蛋白（包括穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素）介导。

2、自体nk细胞已经用作治疗实体。为此，从全血的外周血淋巴细胞级分中分离出nk细胞，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新输注至受试者中。自体nk细胞至少在某些情况下显示出在离体治疗和体内治疗中具有中等有效性。然而，自体nk细胞的分离和生长需要大量的时间和成本。此外，并非所有nk细胞均具有细胞溶解作用，这进一步限制了自体nk细胞疗法。

3、这些困难中的至少一些可以通过使用nk-92细胞来克服，nk-92细胞是一种细胞溶解性癌细胞系，其是在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现的，然后在体外无限增殖（gong等人，leukemia [白血病] 8: 652-658 (1994)）。虽然nk-92细胞是nk细胞的衍生物，但nk-92细胞缺乏正常nk细胞所具有的主要抑制受体，而保留了大部分活化受体。但是，nk-92细胞不会攻击正常细胞，也不会引发人体无法接受的免疫排斥反应。由于这些预期特性，nk-92细胞被详细表征，并被探索用作治疗某些癌症的治疗剂，例如，如wo 1998/049268或us 2002/068044所述。

4、区分肿瘤细胞和来源于同一组织的正常细胞的表型变化通常与特定基因产物表达方面的一种或多种变化有关，包括正常细胞表面组分的丢失或其他细胞表面组分的获得（在相应的正常非癌组织中无法检测到的抗原）。在赘生性细胞或肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原或在赘生性细胞中表达的水平大大高于正常细胞中发现的水平的抗原被称为“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”。此类肿瘤特异性抗原可以用作肿瘤表型的标志物。肿瘤特异性抗原包括癌症/睾丸特异性抗原（例如，mage、bage、gage、prame和ny-eso-1）、黑素细胞分化抗原（例如，酪氨酸酶、melan-a/mart、gpl00、trp-1和trp-2）、突变或异常表达的抗原（例如，mum-1、cdk4、β-连环蛋白、gp100-in4、p15和n-乙酰葡萄糖胺基转移酶v）以及在肿瘤中表达水平较高的抗原（例如，cd19和cd20）。

5、肿瘤特异性抗原已被用作癌症免疫疗法的靶标。一种这样的疗法利用在包括t细胞和nk细胞在内的免疫细胞表面上表达的嵌合抗原受体（car）来改善针对癌细胞的细胞毒性。car包含连接至至少一个细胞内信号传导结构域的单链可变片段（scfv）。scfv识别并结合靶细胞（例如癌细胞）上的抗原，并触发效应细胞活化。信号传导结构域含有基于免疫受体酪氨酸的活化结构域（itam），itam对通过受体的细胞内信号传导非常重要。

6、用于t细胞的第一代car包含一个胞质信号传导结构域。例如，t细胞中第一代car的一个版本包括来自fcε受体γ（fcεriγ）的信号传导结构域，其包含一个itam，而另一个版本包含来自cd3ζ的信号传导结构域，其中cd3ζ包含三个itam。体内和体外研究表明，cd3ζcar t细胞在根除肿瘤方面比fcεriγ car t细胞更有效（例如，haynes等人，2001, j.immunology [免疫学杂志] 166: 182-187；cartellieri等人，2010, j. biomed andbiotech [生物医学与生物技术], vol. 2010, 文章id 956304）。然后进一步的研究表明，此类重组t细胞的完全活化和增殖需要一定的共刺激信号，并且第二代和第三代car将多个信号传导结构域结合到单一car中，以增强重组car t细胞的疗效。由于它们在检测的t细胞中文献报道的效应不太理想，因此第一代car和fcεriγ信号传导结构域被大量放弃，转而使用cd3ζ组合一个或多个另外的信号传导结构域（例如，hermanson和kaufman 2015,frontiers in immunol.[免疫前沿], 第6卷, 文章195）。

7、最近，选择的car也已经在nk细胞中表达。例如，car修饰的nk-92细胞已使用仅具有cd3ζ细胞内信号传导结构域的第一代car。这些第一代car-nk细胞已靶向多种抗原，包括用于b细胞淋巴瘤的cd19和cd20，用于乳腺癌、卵巢癌和鳞状细胞癌的erbb2，用于神经母细胞瘤的gd2，以及用于多发性骨髓瘤的cd138。还已经针对几种抗原构建了来自nk-92系的第二代car-nk细胞，包括用于多种癌的epcam，用于eb（epstein-barr）病毒的hla-a2 ebna3复合体，用于多发性骨髓瘤的cs1，以及用于her2阳性上皮癌的erbb2。在第二代nk-92 car中，与cd3ζ一起使用的最常见的细胞内共刺激结构域是cd28。然而，由于nk细胞不自然表达cd28，因此尚不清楚cd28结构域的潜在作用。另外的第二代car已将4-1bb细胞内信号传导结构域与cd3ζ结合在一起，以改善nk细胞的持久性。其他人则使用与单独cd3ζ融合的erbb2scfv、cd28和cd3ζ、或4-1bb和cd3ζ比较了不同细胞内结构域对乳腺癌细胞的功能性。他们发现，与第一代car相比，两种第二代构建体均具有更好的杀伤力，cd28和cd3ζ具有65%的靶标裂解，4-1bb和cd3ζ裂解了62%，单独cd3ζ杀伤了51%的靶标。在最近的研究中，还使用在nk-92细胞上表达的抗cd19 car对4-1bb和cd28细胞内结构域用于b细胞恶性肿瘤进行了比较。还有其他人发现，cd3ζ/4-1bb构建体在细胞杀伤和细胞因子产生方面不如cd3ζ/cd28有效，突出了cd28和4-1bb共刺激结构域的不同作用。

8、第三代nk-92 car由具有cd3ζ、cd28和4-1bb细胞内信号传导结构域的抗cd5 scfv构建，并已证明对多种t细胞白血病和淋巴瘤细胞系以及原发性肿瘤细胞具有特异性和强效的抗肿瘤活性。此类细胞还能够在t细胞急性淋巴细胞白血病（all）细胞系和原发性肿瘤细胞的异种移植小鼠模型中抑制疾病进展（transl res.[转化医学研究] 2017年9月；187:32-43）。在进一步的实例中，wo 2016/201304和wo 2018/076391教导了在nk细胞和nk-92细胞中表达的第三代cd3ζ car的用途。

9、自体nk细胞和nk-92细胞需要外源il-2作为生存因子和潜在细胞毒性的增强剂。不幸的是，il-2的全身施用通常与显著的非预期不良副作用和毒性有关。为了克服这些问题，可以在向患者施用前在体外培养和扩增细胞。尽管il-2将实现生成足够量的nk细胞或nk-92细胞，但在大规模生产nk细胞中使用外源il-2通常成本高昂。外源il-2的需求可通过逆转录病毒载体中局限于内质网的il-2的重组表达来解决（见exp hematol [实验血液学]. 2005 feb;33(2): 159-64）。此类方法消除了对外源il-2的需求。但是，逆转录病毒的转染效率通常不理想，在待表达多个重组基因的情况下效率甚至更低。

10、此外，如对nk-92细胞进行工程改造以表达fc受体的多次失败所证明，nk细胞，尤其是nk-92细胞通常很难进行基因修饰。当nk-92细胞转染多种重组基因或相对较大的重组核酸有效载荷用于异源表达时，这些困难进一步加剧。此外，nk-92细胞在外源蛋白(例如，cd16)重组表达方面也表现出明显缺少可预测性。在功能水平上，大多数（如若非全部）carnk-92细胞需要相对高效靶比，这可能是由于car构建体的表达相对较低。而且，此类carnk-92细胞的细胞毒性也将随时间迅速下降，从而使此类细胞在临床上不太有吸引力。

11、因此，尽管在本领域已知有大量的重组nk-92细胞，但所有或几乎所有的重组细胞均遇到各种困难。因此，仍需要表达car的nk-92细胞，其表达大量高活性car并伴有持续的细胞毒性，并易于以简单有效的方式进行培养。

技术实现思路

1、发明人发现，nk-92细胞可以有效地转染重组核酸以表达含fcεriγ的car。出乎意料的是，具有fcεriγ信号传导结构域的car显著增加car的表达水平，并进一步传递细胞毒性随时间延长。设想的编码car的重组核酸优选为三顺反子排列，其还包括编码cd16或cd16变体，和/或il-2或il-2变体的序列部分。有利地，此类重组核酸不仅提供选择转染细胞的有效方式（因为il-2不仅提供自分泌生长刺激，而且还充当共表达蛋白的选择标志物），还可产生具有优异细胞溶解活性的car nk细胞（例如，与其他构建体相比，效靶比相对较低），并且cd16和含fcεriγ的car的表达水平较高。

2、因此，在本发明主题的一个方面，发明人设想了一种基因修饰的nk细胞，其重组表达细胞因子、cd16和膜结合的嵌合抗原受体（car）。car的单条多肽链中通常包含 (i) 细胞外结合结构域、(ii) 铰链结构域、(iii) 跨膜结构域和 (iv) fcεriγ信号传导结构域（例如，具有seq id no:1所示的氨基酸序列）。

3、在许多实施例中，nk细胞是nk-92细胞，和/或重组表达的细胞因子是或包括il-2或il-15（其可以进一步包括内质滞留序列）。在其他实施例中，cd16可以是高亲和力cd16变体（例如，cd16158v）。

4、优选地，但非必须地，细胞外结合结构域将包含可以与以下项特异性结合的scfv：肿瘤特异性抗原（例如，cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her-2、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、muc-1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、cspg-4、igf1-r、flt-3、cd276、cd123、pd-l1、bcma或cd33）、肿瘤相关抗原、或患者和肿瘤特异性抗原，或者可以与病毒特异性抗原（例如，hiv病毒、hpv病毒、rsv病毒、流感病毒、埃博拉病毒或hcv病毒的抗原）。

5、在一些实施例中，细胞因子、cd16和car由三顺反子重组核酸表达，而在其他实施例中，细胞因子和/或cd16由整合到nk细胞基因组中的重组核酸表达。

6、因此，发明人还设想了一种重组核酸，其包括编码细胞因子的第一序列部分、编码cd16的第二序列部分和编码嵌合抗原受体（car）的第三序列部分，所述car的单条多肽链中包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和fcεriγ信号传导结构域。最典型地，第一、第二和第三序列部分位于同一核酸上。

7、尽管在一些实施方式中，该核酸是三顺反子rna，但是在其他实施方式中，该核酸是三顺反子dna。

8、而且，通常优选地，细胞因子是il-2或il15（其可以包括或可以不包括内质滞留序列），cd16是具有158v突变的高亲和力cd16变体，和/或细胞外结合结构域包括scfv。如前所述，细胞外结合结构域可以与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者和肿瘤特异性抗原特异性结合，或者细胞外结合结构域可以与病毒特异性抗原特异性结合。

9、在进一步设想的方面，该铰链结构域和/或该跨膜结构域包含cd8铰链结构域和/或cd28跨膜结构域，而该fcεriγ信号传导结构域可以具有seq id no:2所示的核酸序列。

10、在本发明主题的其他方面，发明人还设想了一种重组细胞，其包含如上和本文所述的重组核酸。在制备和/或扩增核酸的情况下，重组细胞可以是细菌细胞。另一方面，在待表达重组核酸的情况下，细胞通常是自体nk细胞或nk细胞（也可以是任选地经基因修饰的nk-92细胞）。

11、因此，发明人还设想了一种治疗有需要的患者的癌症的方法。在此类方法中，向患者施用治疗有效量的任一种基因修饰的nk细胞，从而治疗癌症。此外，以及在预期的情况下，设想的方法可以包括施用至少一种另外的治疗实体的进一步步骤，该另外的治疗实体选自由以下组成的组：病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、n-803、抗体、干细胞移植物和肿瘤靶向细胞因子。

12、在其他癌症中，设想的癌症包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞（粒细胞）白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

13、同样，发明人还设想了一种治疗有需要的患者的病毒感染的方法。在此类方法中，向患者施用治疗有效量的任一种基因修饰的nk细胞，从而治疗病毒感染。在预期或有需要的情况下，还可以施用抗病毒药。

14、无论治疗类型如何，通常设想向患者施用约1 x 108至约1 x 1011个细胞/m2患者体表面积。从不同的角度来看，设想了如本文所述的基因修饰的nk细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。

15、通过以下优选的实施例的详细描述以及附图（其中相同的附图标记表示相同的组件），本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见。