一种用于鉴定乌鳢性别的KASP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种用于鉴定乌鳢性别的kasp分子标记及其应用。

背景技术：

1、乌鳢(channa argus)属攀鲈目(anabantiformes)鳢科(channidae)鳢属(channa)，在我国广泛分布于长江、黄河、辽河和黑龙江等流域的水系，常见于池塘、河流、湖泊、水库等淡水水体。乌鳢具有肉质细腻鲜美、蛋白质高、鱼刺少等特点，而且生长快，产量高，是我国传统的食用养殖鱼类。由于乌鳢难以驯食人工配合饲料，能食用人工配合饲料且具有显著杂交优势的乌斑杂交鳢(c.argus♀×c.maculata♂)和斑乌杂交鳢(c.maculata♀×c.argus♂)已成为我国鳢科鱼类的主要养殖对象，但乌鳢作为杂交鳢的亲本之一，持续地对乌鳢进行种质改良和创新依然至关重要。

2、乌鳢和杂交鳢都存在着显著的性别二态性，雌雄个体在生长速度、个体大小和饲料利用率等方面差异显著。雄性个体生长速度快、个体大、饲料系数低，而雌鱼生长慢、个体小，且性腺发育导致饲料系数升高、运输成活率低。为解决雌雄差异影响养殖效益问题，全雄杂交鳢“雄鳢1号”(c.argus♀xx×c.maculata♂yy)已经培育成功，其雄性率93％以上，在相同养殖条件下，生长速度比普通乌斑杂交鳢(c.argus♀×c.maculata♂)高25％以上，饲料系数降低0.2～0.35，1kg上大规格优质鱼比例提高20％以上，综合养殖效益提高40％以上。杂交鳢“雄鳢1号”的成功培育说明了全雄杂交鳢具有优良的生长性状和广阔的市场前景。但由于乌斑杂交鳢和斑乌杂交鳢在养殖模式和最佳养殖区域上存在着差异，杂交鳢“雄鳢1号”依旧不能完全满足需求，行业和市场对全雄斑乌杂交鳢(c.maculata♀xx×c.argus♂yy)存在着广泛的需求。

3、培育全雄的斑乌杂交鳢的关键之一在于获得鉴定乌鳢性别的分子标记，以此来筛选遗传性别为雄性的乌鳢，以及培育出的超雄乌鳢(yy)。现阶段，已有一些能鉴定乌鳢遗传性别的分子标记，但现有的鉴定乌鳢遗传性别的标记或为显性标记，准确度较低，稳定性不好，不适合用于大规模的分子标记辅助选择育种，或依赖于特定的仪器和试剂，通用性、灵活性以及易用性不佳，严重影响乌鳢全雄系和超雄系的纯化速度及品种选育进程。

技术实现思路

1、本发明旨在开发一种简便、准确、高通量且适应于大量样本的检测乌鳢雌雄和超雄性别的鉴定技术。

2、本发明第一方面的目的，在于提供与乌鳢性别基因紧密连锁的indel标记。

3、本发明第二方面的目的，在于提供用于扩增本发明第一方面的indel标记的kasp引物。

4、本发明第三方面的目的，在于提供一种试剂或试剂盒。

5、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的indel标记、本发明第二方面的kasp引物、本发明第三方面的试剂或试剂盒的应用。

6、本发明第五方面的目的，在于提供一种方法。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供与乌鳢性别基因紧密连锁的indel标记，所述indel标记为位于乌鳢基因组第16号染色体上，含有11556701-11556723处的多态性为“agctctgatcacagaaacaagt/----------------------”位点的核苷酸序列；其中，-表示indel的缺失。

9、本发明中indel标记的物理位置是基于乌鳢基因组(channa argus genomeassembly asm1899790v1)。

10、在本发明一些实施方式中，多态性位点碱基为“----------------------”的纯合基因型对应乌鳢为雌性，多态性位点碱基为“agctctgatcacagaaacaagt/----------------------”杂合基因型对应乌鳢为雄性，多态性位点碱基为“agctctgatcacagaaacaagt”的纯合基因型对应乌鳢为超雄。

11、本发明的第二个方面，提供用于扩增本发明第一方面的indel标记的kasp引物，包括正向引物x、正向引物y和反向引物；

12、其中，所述正向引物x含有如seq id no:10(5’-atgactgttgctaccactacacaa-3’)所示的核苷酸序列；

13、所述正向引物y含有如seq id no:11(5’-atgactgttgctaccactacacag-3’)所示的核苷酸序列；

14、所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:7(5’-cacaatctttaccaaaccaccatcaaacaact-3’)所示。

15、在本发明一些实施方式中，所述正向引物x和正向引物y含有荧光基团的标签序列，所述正向引物x和正向引物y的荧光基团不同。

16、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团的标签序列位于所述正向引物x和正向引物y的5’端。

17、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团选自fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red、cy5、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的任意一种。

18、在本发明一些实施方式中，所述正向引物x的5’端加上fam荧光的标签序列如seqid no:8所示。

19、在本发明一些实施方式中，所述正向引物x的核苷酸序列如seq id no:5所示。

20、在本发明一些实施方式中，所述正向引物y的5’端加上hex荧光的标签序列如seqid no:9所示。

21、在本发明一些实施方式中，所述正向引物y的核苷酸序列如seq id no:6所示。

22、本发明的第三个方面，提供一种试剂或试剂盒，包括本发明第二方面的kasp引物。

23、在本发明一些实施方式中，所述试剂或试剂盒中还含有dna聚合酶，dntp和mgcl2。

24、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括tret cassette荧光引物和rox内参染料。

25、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的indel标记、本发明第二方面的kasp引物、本发明第三方面的试剂或试剂盒在以下任一方面的应用：

26、1)鉴定乌鳢的性别；

27、2)用于与乌鳢性别相关的分子标记辅助育种；

28、3)乌鳢基因分型；

29、4)构建乌鳢dna指纹图谱。

30、本发明的第五个方面，提供一种方法，包括使用本发明第二方面的kasp引物、本发明第三方面的试剂或试剂盒检测待测乌鳢基因组中本发明第一方面的indel标记的步骤；

31、所述方法包括1)～4)中任意一种：

32、1)一种鉴别乌鳢性别的方法；

33、2)一种乌鳢的辅助育种的方法；

34、3)一种乌鳢基因分型的方法；

35、4)一种构建乌鳢dna指纹图谱的方法。

36、在本发明一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

37、(1)提取待测乌鳢基因组dna；

38、(2)以dna为模板，利用本发明第二方面的kasp引物或本发明第三方面的试剂或试剂盒进行pcr扩增；

39、(3)分析pcr扩增产物，得到待测乌鳢基因组中indel标记的多态性。

40、在本发明一些实施方式中，当多态性位点碱基为“----------------------”的纯合基因型对应乌鳢为雌性；多态性位点碱基为“agctctgatcacagaaacaagt/----------------------”杂合基因型对应乌鳢为雄性，多态性位点碱基为“agctctgatcacagaaacaagt”的纯合基因型对应乌鳢为超雄。

41、本发明的有益效果是：

42、本发明提供一种与乌鳢性别基因紧密连锁的分子标记，可以准确鉴定乌鳢的遗传性别。

43、本发明还提供一种用于扩增乌鳢性别基因紧密连锁的分子标记的特异性kasp引物，可以对乌鳢的遗传性别进行检测，简单易用、分析通量高，准确性高，适用于大量样本的检测。本发明提供的分子标记对于快速准确筛选伪雌乌鳢和超雄乌鳢，缩短育种时间，提高育种效率具有重要实践意义。