一种肾上腺类器官培养基及其应用的制作方法

本发明涉及类器官培养，具体涉及一种肾上腺类器官培养基及其应用。

背景技术：

1、肾上腺是人体内分泌系统中重要的器官，位于人体两肾的上方，左右各一，并由肾筋膜与脂肪组织包裹。肾上腺由外侧的肾上腺皮质和内侧的肾上腺髓质组成，而二者在发育、结构和功能上均有不同。来自外胚层的肾上腺髓质由来自中胚层的皮质包裹，髓质内的嗜铬细胞为机体提供了肾上腺激素等，肾上腺皮质则负责利用胆固醇合成皮质类固醇激素，两种结构相互作用，协同调控机体的各项生命活动，维持人体稳态。因此，肾上腺是人体重要的器官，若发生功能障碍或缺少及时的修复将导致多种代谢紊乱疾病的发生。腺体本身的增生、肿瘤化，或受到其他发病组织的影响亦将造成激素失调，最终危及生命安全。

2、类器官是指将干细胞或前体细胞在体外三维培养，通过细胞自我增殖、定向分化和谱系定型及自我组装形成的，具有器官特异性的细胞组成、关键结构和功能特性的培养物。类器官能够部分甚至完全还原体内器官的细胞构成和结构功能，并在长期扩增的同时保持遗传和表型的稳定，解决了传统生物模型无法模拟组织器官的困难，使体外组织器官的研究从二维细胞的表层水平转向三维组织的深层水平，为器官发育等基础研究提供了一个良好模型，为医学转化和疾病治疗开辟了一条创新途径。

3、目前市面上缺少肾上腺类器官培养基，因而暂时没有肾上腺类器官以及衍生的疾病模型，由于研究模型的缺失，世界上对于肾上腺及相关疾病的研究非常有限，人们无法在体外观察干涉肾上腺的组织发生和激素分泌等生命活动，也无法研究肾上腺的疾病产生和损伤修复，也使得临床对于肾上腺疾病的治疗方法难以得到完善。因此亟需研发一种适于肾上腺类器官稳定生长的培养方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

2、因此，本发明第一方面提供一种肾上腺类器官培养基，所述培养基包括基础培养基组分和添加剂，其中，

3、所述添加剂包含fgf2、wnt-3a、atch。

4、本发明提供了一种适于肾上腺类器官稳定生长的培养方法，采用本发明的培养基对肾上腺类器官进行培养，具有培养周期短、增殖快、细胞数量和细胞存活率高、以及可长期稳定传代的优点，为体外观察、干涉肾上腺的组织发生和激素分泌及研究肾上腺的疾病产生和损伤修复等生命活动奠定了基础。

5、为了提高肾上腺类器官原代培养和传代扩增的成功率，满足肾上腺类器官的营养需求，本发明提出了一种肾上腺类器官的培养基，所述培养基含有fgf2、wnt-3a和atch因子。通过实验验证，这三种因子对肾上腺类器官生长尤为重要，其中fgf2是成纤维细胞生长因子家族的一员，能够与特定的成纤维细胞生长因子受体(fgfr)结合，能够促进细胞增殖、组织修复，以及参与血管生成；wnt-3a是wnt基因的转录产物，wnt信号通路的关键因子，通过与wnt受体结合而对β-catenin进行正反馈调节，能够维持细胞干性；atch是肾上腺皮质激素，是脊椎动物脑垂体分泌的一种多肽类激素，能够维持肾上腺皮质的组织增生、促进肾上腺类器官的自组织能力、协助肾上腺的功能完善。发明人发现，在肾上腺类器官的培养过程中，fgf2能支持肾上腺类器官形成紧密的球体结构，wnt-3a能够支持肾上腺类器官的以较高的数量生长，atch能诱导肾上腺类器官分泌颗粒，这三个因子及其对应功能对肾上腺细胞的自组织能力以及微环境的还原至关重要。

6、根据本发明的具体实施方案，所述fgf2的浓度为2-100ng/ml，优选为5-50ng/ml，进一步优选为10-30ng/ml，当培养基中的fgf2在此浓度范围内能够保证肾上腺类器官的生长状态较好，促进细胞存活和细胞增殖，使肾上腺类器官形成紧密的球体结构。

7、根据本发明的具体实施方案，所述wnt-3a的浓度为50-500ng/ml，优选为70-400ng/ml，进一步优选为100-300ng/ml，当培养基中的wnt-3a在此浓度范围内能够上调wnt/β-catenin通路，保证肾上腺类器官的生长状态良好，维持细胞干性。

8、根据本发明的具体实施方案，所述atch的浓度为0.5-10nm，优选为1-8nm，进一步优选为1-5nm，当培养基中的atch在此浓度范围内能够维持肾上腺细胞的增殖，促进肾上腺类器官的自组织能力，诱导分泌颗粒的形成。

9、根据本发明的具体实施方案，所述添加剂进一步包括egf、fgf7、fgf10。

10、根据本发明的具体实施方案，所述egf的浓度为50-500ng/ml，优选为70-200ng/ml。

11、根据本发明的具体实施方案，所述fgf7的浓度为1-100ng/ml，优选为10-50ng/ml。

12、根据本发明的具体实施方案，所述fgf10的浓度为50-500ng/ml，优选为70-200ng/ml。

13、根据本发明的具体实施方案，所述添加剂进一步包括抗凋亡因子rock抑制剂(y27632)、alk-5抑制因子(a83-01)、n-乙酰半胱氨酸、r-spondin、nicotinamid。

14、根据本发明的具体实施方案，所述抗凋亡因子rock抑制剂(y27632)的浓度为2-20μm，优选为5-15μm。

15、根据本发明的具体实施方案，所述alk-5抑制因子(a83-01)的浓度为100-1000nm，优选为300-800nm。

16、根据本发明的具体实施方案，所述n-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1-3mm，优选为0.5-2mm。

17、根据本发明的具体实施方案，所述r-spondin的浓度为100-1000ng/ml，优选为300-800ng/ml。

18、根据本发明的具体实施方案，所述nicotinamid(烟酰胺)的浓度为50-500ng/ml，优选为50-200mm。

19、根据本发明的具体实施方案，所述添加剂的组分包括fgf2、wnt-3a和atch的至少之一，以及n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、抗凋亡因子rock抑制剂、alk-5抑制因子、egf、r-spondin、fgf7、fgf10。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有上述的添加物时，对肾上腺类器官的生长有明显的促进作用，提高肾上腺类器官的细胞活性。

20、根据本发明的实施例，所述添加物包括fgf2、n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、抗凋亡因子rock抑制剂、alk-5抑制因子、egf、r-spondin、fgf7、fgf10。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，对肾上腺类器官的生长有明显的促进作用，提高肾上腺类器官的细胞活性。

21、根据本发明的实施例，所述添加物包括wnt-3a、n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、抗凋亡因子rock抑制剂、alk-5抑制因子、egf、r-spondin、fgf7、fgf10。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，对肾上腺类器官的生长有明显的促进作用，提高肾上腺类器官的细胞活性。

22、根据本发明的实施例，所述添加物包括atch、n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、抗凋亡因子rock抑制剂、alk-5抑制因子、egf、r-spondin、fgf7、fgf10。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，对肾上腺类器官的生长有明显的促进作用，提高肾上腺类器官的细胞活性。

23、根据本发明的实施例，所述添加物包括fgf2、wnt-3a、atch、n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、抗凋亡因子rock抑制剂、alk-5抑制因子、egf、r-spondin、fgf7、fgf10。发明人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，对肾上腺类器官的生长有明显的促进作用，提高肾上腺类器官的细胞活性。

24、根据本发明的具体实施方案，本技术中所涉及的“fgf2”是成纤维细胞生长因子家族的一员，能够与特定的成纤维细胞生长因子受体(fgfr)结合，具有促进细胞增殖、组织修复以及参与血管生成的功能；本技术中所涉及的“wnt-3a”是wnt基因的转录产物，wnt信号通路的关键因子，通过与wnt受体结合而对β-catenin进行正反馈调节，维持细胞干性；atch是肾上腺皮质激素，是脊椎动物脑垂体分泌的一种多肽类激素，能够促进肾上腺皮质的组织增生，协助肾上腺的功能完善，诱导分泌颗粒的形成；本技术中所涉及的“抗凋亡因子rock抑制剂”为y27632(rock为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞自噬和凋亡的调控中发挥关键作用)；本技术中所涉及的“alk-5抑制因子”为a83-01(a83-01是一个强有力的tgf-βⅰ型受体alk-5(ic50：12nm)/alk4((ic50：45nm)/alk 7(ic50：7.5nm)激酶的抑制剂，a83-01对alk-5的抑制作用很强)；本技术所述的“egf”是表皮细胞生长因子；本技术所述的“r-spondin”是wnt/β-catenin信号通路的激动剂；本技术所述的“fgf7”是成纤维细胞生长因子7，fgfr2b的配体；本技术所述的“fgf10”是成纤维细胞生长因子10，fgfr2b的配体。

25、根据本发明的具体实施方案，所述添加剂进一步包括氢离子缓冲剂(hepes)、l-谷氨酰胺、血清替代物(b plus)。

26、根据本发明的具体实施方案，所述氢离子缓冲剂(hepes)的体积分数为0.1-5％，优选为0.5-2％。

27、根据本发明的具体实施方案，所述l-谷氨酰胺的体积分数为0.1-5％，优选为0.5-2％。

28、根据本发明的具体实施例，所述氢离子缓冲剂在所述培养基中的体积分数为1％。

29、需要说明的是，本技术所述的“氢离子缓冲剂”储液中的成分为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，该成分浓度为1m。

30、根据本发明的实施例，所述l-谷氨酰胺在所述培养基中的体积分数为0.5-2％。

31、根据本发明的具体实施例，所述l-谷氨酰胺在所述培养基中的体积分数为1％。

32、需要说明的是，本技术所述的“l-谷氨酰胺”储液的浓度为200mm。

33、所述血清替代物(b plus)的体积分数为0.5-10％，优选为1-5％

34、本技术所述的“血清替代物(b plus)”是基于b27进行改进的血清成分替代物，能够添加到培养基中促进细胞的生长繁殖。

35、根据本发明的具体实施方案，所述培养基进一步包括抗菌成分，抗菌成分可避免肾上腺类器官被污染。

36、根据本发明的具体实施方案，所述抗菌成分可以是本领域已知的任意有效剂量的，不影响细胞生长的具有抗菌作用的抗生素或其他物质，包括青霉素/链霉素双抗溶液。

37、根据本发明的具体实施方案，所述青霉素在所述培养基中的浓度为50-200u/ml，优选为90-110u/ml。

38、根据本发明的具体实施方案，所述链霉素在所述培养基中的浓度为0.01-1mg/ml，优选为0.05-0.5mg/ml。

39、根据本发明的具体实施方案，所述基础培养基包括选自advanced dmem/f12、ham’s f-12、silac advanced dmem/f-12flex、dmem/f-12、william's e培养基中的任意一种。

40、根据本发明的实施例，所述n-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的浓度为1-1.5mm，所述烟酰胺在所述培养基中的浓度为0.05-1μg/ml，所述抗凋亡因子rock抑制剂在所述培养基中的浓度为5-20μm，所述alk-5抑制因子在所述培养基中的浓度为0.1-1μm，所述egf在所述培养基中的浓度为0.05-1μg/ml，所述r-spondin在所述培养基中的浓度为0.5-1μg/ml，所述fgf7在所述培养基中的浓度为20-30ng/ml，所述fgf10在所述培养基中的浓度为50-150ng/ml，所述血清替代物b plus在所述培养基中的体积分数为1％-3％。发明人经过不断试验发现，当培养基中的成分在此浓度范围内能够保证肾上腺类器官的生长状态较好，细胞活性较高，为后续科研人员对肾上腺的研究奠定了基础。

41、根据本发明的实施例，所述n-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的浓度为1-1.5mm，所述烟酰胺在所述培养基中的浓度为0.05-0.2μg/ml，所述抗凋亡因子rock抑制剂在所述培养基中的浓度为5-20μm，所述alk-5抑制因子在所述培养基中的浓度为0.2-0.8μm，所述egf在所述培养基中的浓度为0.05-1μg/ml，所述r-spondin在所述培养基中的浓度为0.5-1μg/ml，所述fgf7在所述培养基中的浓度为20-30ng/ml，所述fgf10在所述培养基中的浓度为50-150ng/ml，所述血清替代物b plus在所述培养基中的体积分数为1-3％。发明人经过不断试验发现，当培养基中的成分在此浓度范围内能够保证肾上腺类器官的生长状态较好，细胞活性较高，为后续科研人员对肾上腺的研究奠定了基础。

42、根据本发明的实施例，所述n-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的浓度为1-1.5mm，所述烟酰胺在所述培养基中的浓度为0.05-1μg/ml，所述y27632在所述培养基中的浓度为5-20μm，所述a83-01在所述培养基中的浓度为0.1-1μm，所述egf在所述培养基中的浓度为0.05-1μg/ml，所述r-spondin在所述培养基中的浓度为0.5-1μg/ml，所述fgf7在所述培养基中的浓度为20-30ng/ml，所述fgf10在所述培养基中的浓度为50-150ng/ml，所述血清替代物b plus在所述培养基中的浓度为1-3％。发明人经过不断试验发现，当培养基中的成分在此浓度范围内能够保证肾上腺类器官的生长状态较好，细胞活性较高，为后续科研人员对肾上腺的研究奠定了基础。

43、根据本发明的实施例，所述n-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的浓度为1-1.5mm，所述烟酰胺在所述培养基中的浓度为0.05-0.2μg/ml，所述y27632在所述培养基中的浓度为5-20μm，所述a83-01在所述培养基中的浓度为0.2-0.8μm，所述egf在所述培养基中的浓度为0.05-1μg/ml，所述r-spondin在所述培养基中的浓度为0.5-1μg/ml，所述fgf7在所述培养基中的浓度为20-30ng/ml，所述fgf10在所述培养基中的浓度为50-150ng/ml，所述血清替代物b plus在所述培养基中的浓度为1％-3％。发明人经过不断试验发现，当培养基中的成分在此浓度范围内能够保证肾上腺类器官的生长状态较好，细胞活性较高，为后续科研人员对肾上腺的研究奠定了基础。

44、根据本发明的实施例，所述fgf2在所述培养基中的浓度为0.01-0.1μg/ml，所述wnt-3a在所述培养基中的浓度为0.1-1μg/ml，所述atch在所述培养基中的浓度为1-5nm。优选地，所述fgf2在所述培养基中的浓度为0.01-0.03μg/ml，所述wnt-3a在所述培养基中的浓度为0.1-0.5μg/ml，所述atch在所述培养基中的浓度为2-3nm。当培养基中的fgf2、wnt-3a和atch在此浓度范围内能够保证肾上腺类器官的生长状态较好，细胞活性较高，类器官仿生能力较强。

45、本发明第二方面提供了第一方面所述的培养基在培养肾上腺类器官中的用途。

46、本发明第三方面提供一种培养肾上腺类器官的方法，所述方法包括：将含有肾上腺成体干细胞的样本在第一方面所述的培养基中培养。

47、根据本发明的具体实施方案，所述方法进一步包括，

48、(a)对所述含有肾上腺成体干细胞的样本进行消化处理，以获得肾上腺细胞团；

49、(b)利用第一方面所述的培养基培养所述肾上腺细胞团。

50、根据本发明的实施例，所述方法包括：将肾上腺细胞在前面所述培养基中进行悬浮培养处理，以便获得肾上腺类器官。通过此方法培养的肾上腺类器官具有较好的形态，能够促进肾上腺类器官的快速生长，类器官数量大幅升高，细胞存活率也大大提升。

51、根据本发明的实施例，所述肾上腺细胞分离自肾上腺组织。

52、本发明第四方面提供一种肾上腺皮质腺瘤类器官的构建方法，所述方法包括：使肾上腺单细胞和/或肾上腺类器官表达具有l206r突变的prkaca蛋白。根据本发明的具体实施方案的肾上腺皮质腺瘤类器官的构建方法能够成功获得肾上腺皮质腺瘤类器官模型，为肾上腺皮质腺瘤疾病的科学研究以及治疗提供了可用的工具。

53、prkaca蛋白是camp的调节亚基，其206位突变会导致camp信号通路持续激活，导致肿瘤发生，同时产生过量糖皮质激素，prkaca-l206r蛋白突变是导致产生过量内源性皮质醇的肾上腺皮质腺瘤的主要原因。

54、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。