一种检测小豆种皮是否为黑色的PCR试剂盒及其应用

本发明属于分子标记技术开发及应用，具体涉及一种检测小豆种皮是否为黑色的pcr试剂盒及其应用。

背景技术：

1、小豆(vigna angularis)是一种重要的豆科作物。大约于大约12000年前，它在中国被驯化，并在30多个国家广泛种植，主要在中国、日本和韩国。小豆是作为一种传统的中药植物和健康食品。种皮颜色是一种重要的驯化性状、商品品质性状和营养品质性状。黄酮类化合物组分的差异是小豆种皮颜色的变化，使小豆具有不同的颜色。类黄酮代谢物具有极强的营养和药用价值，其抗氧化和抗诱变活性与人类健康密切相关。

2、小豆又被称为红小豆，原因是其绝大多数地方品种和改良品种的种皮颜色均为红色，然而几乎所有的野生小豆(vigna angularisvar.nipponensis)的种皮色均为灰底黑斑。且不同地方品种小豆具有十分丰富的种皮颜，如：红色、黑色、白色、橙色、淡褐色、灰底黑斑、红底黑斑、绿色等。

3、小豆的种皮是由珠被发育而来，其基因型与植株相同，在传统的小豆品种选育过程中，种皮颜色的鉴定需待小豆完全成熟后利用肉眼观察及色彩色差计鉴定，与其他如株高、地径、有效分枝始节、主茎分支数可在田间进行鉴定的重要性状相比有严重的滞后性，极大的延缓了小豆育种的效率。

4、分子标记是以核酸的多态性为基础的遗传标记。其不受组织类别、发育时期、环境条件等干扰，具有数量极多、多态性高等优点，是理想的遗传标记。分子标记已广泛应用于种质资源研究、杂种鉴定、遗传图谱构建、目的基因定位、遗传多样性、亲缘关系研究以及标记辅助选择育种。其中，单核苷酸多态性标记(snp)，是基于高通量测序技术获得的均匀分布于基因组中的单碱基转换与颠换；具有多态性高、稳定性好、多等位基因、共显性、数量丰富、基因组覆盖性好和操作简单等优点。已广泛应用于中国大豆(glycine max)、菜豆(prunus persica)、鹰嘴豆(cicer arietinum)和绿豆(vigna radiata)等植物的亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、品种选育等研究工作中。snap(single-nucleotide amplifiedpolymorphisms)分子标记是一种将snp转化为可以用pcr鉴定的分子标记的手段。

技术实现思路

1、针对目前现有技术中小豆种皮颜色尚无基于pcr技术的快速检测体系的问题，本发明的目的在于提供一种检测小豆种皮是否为黑色的pcr试剂盒及其应用。本发明利用从小豆品种京农6(jingnong6)基因组数据及322份小豆材料的重测序数据自主开发snap分子标记，仅利用两对引物就能够检测小豆种皮是否为黑色，为小豆种皮颜色检测以及分子标记辅助育种提供重要依据。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种小豆种皮是否为黑色的snap检测引物，包括三条snap分子标记引物，所述snap分子标记引物如下：

4、c3-1375579fa(sdc1-fa)：tgccacacgtgtactcaatgttg；

5、c3-1375579fb(sdc1-fb)：tgccacacgtgtactcaatgttc；

6、c3-1375579r(sdc1-r)：agcactagcagctagactcagttctctt。

7、第二方面，本发明提供一种检测小豆种皮是否为黑色的pcr试剂盒，所述的pcr试剂盒包括上述的小豆种皮是否为黑色的snap检测引物。

8、基于上述技术方案，进一步地，所述的pcr试剂盒还包括taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液、pcr反应增强剂和优化剂以及稳定剂、去离子水。

9、第三方面，本发明提供一种检测小豆种皮是否为黑色的方法，包括以下步骤：

10、(1)提取供试小豆材料的基因组dna；

11、(2)使用上述的snap检测引物对对步骤(1)所获的基因组dna进行pcr扩增；

12、(3)使用琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)所获得的pcr扩增产物进行检测；

13、(4)若引物对c3-1375579fa(sdc1-fa)与c3-1375579r(sdc1-r)扩增产物在184bp位置处有条带，引物对c3-1375579fb(sdc1-fb)与c3-1375579r(sdc1-r)扩增产物在184bp位置处无条带，则所述的供试小豆材料的种皮为黑色；若引物对c3-1375579fa(sdc1-fa)与c3-1375579r(sdc1-r)扩增产物在184bp位置处无条带，引物对c3-1375579fb(sdc1-fb)与c3-1375579r(sdc1-r)扩增产物在184bp位置处有条带，则所述的供试小豆材料的种皮为非黑色。

14、基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的供试小豆材料的品种包括cwa108-1、ag118、京农黑29、京农2、京农5、京农6、京农8、京农22、京农23、河北801、gm633、ag109、cwa154、cwa174、ag163、bd002、cca066、gm290、cca001和ag49。

15、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的pcr扩增的反应体系为10μl，包含正向引物和反向引物各0.4μl、2×flash pcr mastermix(康为世纪生物科技股份有限公司)5μl、模板50-200ng，余量为去离子水。

16、基于上述技术方案，进一步地，正向引物、反向引物的浓度为5-20μmol/l。

17、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的pcr扩增的程序为：94-96℃预变性4-6min；94-96℃变性20-40s，退火温度52-56℃下退火20-40s，71-73℃延伸20-40s，30-40个循环，71-73℃延伸9-11min，降温至1-4℃。

18、基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述的琼脂糖凝胶的浓度为0.5-2％。

19、第四方面，本发明提供上述小豆种皮是否为黑色的snap检测引物、pcr试剂盒的下述①-②中的任一种的用途：

20、①在小豆种皮是否为黑色检测中的应用；

21、②在小豆分子标记辅助育种中的应用。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

23、种皮颜色是小豆重要的商品品质性状，然而在育种过程中往往只能在收获后鉴定，其表型鉴定效率远低于其他植株性状，尚无快速高效的检测方法，本发明通过从小豆品种京农6(jingnong6)基因组数据及322份小豆材料的重测序数据中独立开发了小豆种皮颜色相关的snap分子标记引物，仅利用两对引物就能够检测小豆种皮是否为黑色，对常见的24个小豆品种进行了种皮是否为黑色的鉴定，检测结果和小豆种皮颜色完全相同，本发明具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点，可用于小豆种皮颜色的分子标记辅助育种，进行分子标记分析检测，进而准确鉴别小豆种皮是否为黑色，能快速选择符合育种目标的种皮颜色材料从而提高育种效率，加快育种进程。