羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2-二取代-1,3-环二醇中的应用

本发明属于酶工程和有机合成领域，具体涉及羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2-二取代-1,3-环二醇中的应用。

背景技术：

1、手性二醇具有独特的立体构型和物理化学性质，这使得它们在不对称合成、催化反应和药物合成等领域具有广泛的应用前景。手性二醇的制备方法多种多样，包括化学合成、生物转化和天然提取等，其中化学合成方法可能存在步骤繁琐、转化率低的问题，天然提取的产量较少，生物转化方法利用生物体系中的酶等作为催化剂，将前体化合物转化为具有特定立体构型的手性二醇，立体选择性高且绿色环保。如公开号为cn118652864a的中国专利文献公开了一种羰基还原酶突变体及其应用，该发明通过定向进化手段对novosphingobium aromaticivorans的野生型羰基还原酶进行改造，改造后可用于催化目标二醇产物高产率、高纯度生成。

2、2,2-二取代-1,3-环二醇是非常重要的有机合成中间体，可以进一步转化为许多含有多手性中心的天然产物或甾类化合物，例如乌本甙元(ouabagenin)、trewianin、2,3-dihydrohygrophorone h等。然而，精确构建具有两个或三个手性中心的2,2-二取代-1,3-环二醇的单立体异构体仍然是合成化学中的一大挑战。2,2-二取代-1,3-环二酮直接还原(双羰基还原)是合成2,2-二取代-1,3-环二醇的最直接有效的方法。但2,2-二取代-1,3-环二酮化合物的羰基还原产物有8种之多，包括4种一个羰基被还原的产物和4种两个羰基都被还原的产物，具体如下式所示，其中n为≥1的整数；r为芳香基团；这导致2,2-二取代-1,3-环二醇的立体选择性合成更加困难。

3、

4、另外，目前的合成方法中存在反应条件苛刻，反应立体选择性差，反应步骤复杂等缺点(angew.chem.int.ed.2013,52,5300–5304,j.org.chem.2018,83,13888-13910,j.org.chem.2020,85,9599-9606)。因此开发简单高效的合成手性纯2,2-二取代-1,3-环二醇的方法是十分必要的。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种羰基还原酶突变体，该羰基还原酶突变体能够直接高效、高立体选择性催化2,2-二取代-1,3-环二酮化合物反应合成手性2,2-二取代-1,3-环二醇。

2、具体采用的技术方案如下：

3、羰基还原酶突变体，是由来自短乳杆菌(lactobacillus brevis)的野生型羰基还原酶在如seq id no.1所示的氨基酸序列的第1至251位进行单点突变、双点突变、三点突变、四点突变、五点突变或六点突变而得；

4、具体单点突变的位点为以下任意一种：

5、在95位上的突变；

6、在144位上的突变；

7、在189位上的突变；

8、在198位上的突变；

9、在205位上的突变；

10、在248位上的突变；

11、具体双点突变的位点为以下任意一种：

12、在95位和198位上的组合突变；

13、在143位和144位上的组合突变；

14、在144位和189位上的组合突变；

15、在189位和248位上的组合突变；

16、具体三点突变的位点为以下任意一种：

17、在143位和144位和189位上的组合突变；

18、在144位和189位和248位上的组合突变；

19、具体四点突变的位点为：

20、在143位和144位和189位和248位上的组合突变；

21、具体五点突变的位点为：

22、在93位和143位和144位和189位和248位上的组合突变；

23、在143位和144位和189位和205位和248位上的组合突变；

24、具体六点突变的位点为：

25、在143位和144位和189位和198位和205位和248位上的组合突变。

26、所述羰基还原酶突变体具有催化2,2-二取代-1,3-环二酮化合物生成手性2,2-二取代-1,3-环二醇的催化活性，由短乳杆菌(lactobacillus brevis)来源的野生型羰基还原酶进行改造得到，编码野生型羰基还原酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。

27、进一步的，具体单点突变为以下任意一种：

28、n95i；n95q；e144g；e144a；y189g；y189a；y189c；l198f；l198n；m205g；m205a；y248g；y248a。

29、进一步的，具体双点突变为以下任意一种：

30、n95q且l198f；n95q且l198s；n95q且l198a；i143g且e144g；i143g且e144a；e144g且y189a；e144a且y189a；y189c且m205a；y189a且y248a；y189a且y248g；e144g且y189l。

31、进一步的，具体三点突变为以下任意一种：

32、i143g且e144g且y189g；i143g且e144g且y189a；i143g且e144l且y189c；e144g且y189a且y248g；e144g且y189a且y248a。

33、进一步的，具体四点突变为以下任意一种：

34、i143g且e144g且y189a且y248a；i143g且e144a且y189a且y248a；i143g且e144l且y189a且y248a；i143g且e144g且y189g且y248a；i143g且e144g且y189a且y248l。

35、进一步的，具体五点突变为以下任意一种：

36、a93l且i143g且e144g且y189a且y248a；i143g且e144g且y189a且m205a且y248a；i143g且e144g且y189a且m205a且y248f；i143g且e144g且y189a且m205f且y248a。

37、进一步的，具体六点突变为以下任意一种：

38、i143g且e144g且y189c且l198n且m205a且y248a。

39、优选的，单点突变为：m205a，对应的氨基酸序列如seq id no.3所示。

40、优选的，双点突变为：n95q且l198f，对应的氨基酸序列如seq id no.4所示。

41、优选的，三点突变为：i143g且e144g且y189a，对应的氨基酸序列如seq id no.5所示。

42、优选的，四点突变为：i143g且e144g且y189a且y248l；对应的氨基酸序列分别如seq id no.6所示。

43、本发明还提供了编码所述羰基还原酶突变体的基因。

44、本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码所述羰基还原酶突变体的基因。

45、本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌表达所述羰基还原酶突变体，可由所述重组表达载体转化至宿主微生物中获得。

46、本发明还提供了所述羰基还原酶突变体或所述基因工程菌在合成手性2,2-二取代-1,3-环二醇中的应用。

47、具体的，利用所述羰基还原酶突变体或所述基因工程菌将式ⅰ所示的2,2-二取代-1,3-环二酮直接还原为式ⅱ所示的手性2,2-二取代-1,3-环二醇；

48、

49、其中n为1或2；r为苯基，萘基，对甲氧基苯基，间甲氧基苯基，邻甲氧基苯基，对甲基苯基，间甲基苯基，邻甲基苯基，对氟苯基，间氟苯基，邻氟苯基，对氯苯基，间氯苯基，邻氯苯基，对溴苯基，间溴苯基或邻溴苯基。

50、进一步的，所述手性2,2-二取代-1,3-环二醇为(1s,3s)-2,2-二取代-1,3-环二醇或(1r,3r)-2,2-二取代-1,3-环二醇。

51、本发明还提供了一种合成手性2,2-二取代-1,3-环二醇的方法，方法包括：以2,2-二取代-1,3-环二酮为底物，加入所述基因工程菌发酵培养后得到的粗酶液，以及nadp+、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，20～50℃下反应8～12h，反应完全后，将反应液分离纯化得到手性2,2-二取代-1,3-环二醇。

52、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

53、本发明通过对短乳杆菌(lactobacillus brevis)来源的野生型羰基还原酶进行改造，获得的羰基还原酶突变体在合成手性2,2-二取代-1,3-环二醇方面具有广泛的应用前景，特别是能够实现高选择性合成(1s,3s)-2,2-二取代-1,3-环二醇或(1r,3r)-2,2-二取代-1,3-环二醇。在一个具体的实施例中，该羰基还原酶突变体以2,2-二取代-1,3-环戊二酮为底物催化获得(1s,3s)-2,2-二取代-1,3-环二醇的转化率达到99％，e.e.值达到99％，d.r.值>97/3，获得(1r,3r)-2,2-二取代-1,3-环二醇的转化率达到99％，e.e.值达到99％，d.r.值>99/1。