表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组马立克病毒载体疫苗株及其用途的制作方法

本发明属于兽用生物制品，尤其涉及到一种表达鸡传染性喉气管炎病毒gd蛋白的重组马立克病毒载体疫苗株及其用途。

背景技术：

1、鸡传染性喉气管炎(infectious laryngotracheitis，ilt)是由传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，iltv)引起的鸡的一种急性呼吸道传染病，给全球养禽业造成较大经济损失。

2、ilt的特征为喉头及气管粘膜肿胀出血，严重时可造成糜烂，在当时被称为“气管-喉头炎”、“禽白喉”。根据引起发病毒株的毒力强弱不同，该疾病可表现不同临床症状，轻度临床症状主要表现为患禽的流泪、鼻涕、眶下窦和结膜炎症，而重症常表现为呼吸困难、啰音、气管上皮粘膜出血及纤维素性渗出物。弱毒疫苗免疫鸡和发病鸡痊愈后，iltv可在感染鸡的中枢神经系统，特别是三叉神经节内建立终生潜伏感染。同时，iltv在鸡群间的连续传代后毒力会出现明显增强的现象。

3、对ilt的防控主要依赖疫苗免疫接种。20世纪60年代生产出的鸡胚源和组织培养源性疫苗已广泛用于控制全球ilt疫情。但是，随着减毒活疫苗毒株在鸡群中的不断传播，毒力出现增强现象。有报道指出，iltv鸡胚源疫苗株通过在鸡群之间的连续传代能够发生基因突变且毒力增强。为了克服减毒活疫苗相关问题，科学家们利用基因工程技术研发了可表达iltv主要免疫原性蛋白的火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey，hvt)和鸡痘病毒(fowlpox virus，fpv)载体疫苗，英特威公司推广的hvt-nd-ilt、hvt-ilt在国外广泛使用，但没有在国内上市，据文献报道hvt-nd-ilt、hvt-ilt等hvt载体疫苗免疫保护效果有限，对ilt不能达到100％的免疫保护，并且hvt免疫对马立克病毒强毒的免疫保护效果也不理想。国内使用较多的是哈尔滨兽医研究所研发的fpv-ilt和诗华公司研发生产的fpv-ilt，但由于fpv母源抗体的干扰等，临床单独免疫使用时其免疫保护效果有限。

4、马立克氏病(marek’s disease，md)是由马立克氏病病毒(marek’s diseasevirus，mdv)引起的鸡淋巴组织增生性肿瘤疾病，也是世界范围内流行的家禽主要传染病之一。mdv是一种细胞结合型病毒，分为3个血清型：i型为致瘤的mdv，ii型为不致瘤的mdv，iii型为抗原性相关的火鸡疱疹病毒(hvt)。hvt疫苗因能冻干保存、使用方便，一直被广泛用于预防mdv强毒(vmdv)感染。但是从七十年代后期开始出现了hvt疫苗不能有效保护的mdv超强毒(vvmdv)和特超强毒(vv+mdv)。血清i型mdv疫苗毒株对vmdv、vvmdv及vv+mdv毒株的保护效果显著优于hvt疫苗。随着mdv毒力的不断增强，传统弱毒疫苗cvi988/rispense株对vv+mdv不能提供完全保护的现象时有发生，新型基因工程疫苗成为预防vv+mdv的趋势。

5、基因工程疫苗sc9-1的亲本毒gx0101于2001年在中国广西壮族自治区分离得到，后经山东农业大学崔治中等人敲除掉致病的meq基因得到致弱的sc9-1疫苗株，sc9-1已经获得农业转基因生物安全审批证书(农基安证字(2014)第23号)及新兽药注册证书((2019)新兽药证字25号)。以sc9-1株作为载体构建基因工程疫苗的优势在于：(1)sc9-1属于疱疹病毒，感染鸡体后能引起持续感染，因此一次免疫接种后可以持续表达外源抗原，激发机体产生较强的免疫应答反应；(2)sc9-1具有严格的细胞结合性，在机体内的传播方式是通过细胞之间的直接接触而实现，不受母源抗体的干扰；(3)sc9-1基因组长达180kb，其中有多个位点已经被证实属于病毒复制非必需区，有利于同时插入多个外源基因构建多价疫苗或多联疫苗；(4)sc9-1已经获得新兽药注册证书号，在市场中已经广泛推广应用，安全性有保障；(5)sc9-1作为mdv载体疫苗可胚内或1日龄接种，诱导早期免疫保护，并且表达外源抗原刺激动物机体，既可产生体液免疫，也可产生细胞免疫，免疫保护效果较为理想；(6)sc9-1株与i型cvi988株及ⅲ型hvt株相比，由于其可对马立克氏病提供更好的免疫保护，因此具有更广阔的应用前景。

6、鉴于iltv弱毒活疫苗以及市场化的iltv相关活载体疫苗副反应重、效力不足等问题，急需开发一种新的疫苗来防控鸡传染性喉气管炎和鸡马立克氏病。sc9-1毒株安全性好，对mdv的保护力强，因此作为本发明首选的研究对象。目前虽然有sc9-1作为载体表达鸡传染性法氏囊病毒vp2蛋白、禽流感病毒ha蛋白的相关研究报道，但尚无sc9-1表达鸡传染性喉气管炎相关蛋白的活载体疫苗的研究。并且如本领域技术人员所知晓的，用相同的活载体表达不同的外源蛋白，为了达到最佳的效果，对外源基因的插入位点、启动子和表达盒的选择、基因的优化方式等还都需要漫长的探索。

技术实现思路

1、本发明提供了一种表达鸡传染性喉气管炎病毒gd蛋白的重组马立克病毒载体疫苗株及其用途。该疫苗株可同时诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，避免了灭活疫苗和亚单位疫苗的免疫缺陷，且可同时构成mdv和iltv的二联疫苗，疫苗用量少，免疫保护持续时间长、效果好，无须添加佐剂，降低了成本。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种表达鸡传染性喉气管炎病毒gd蛋白的重组马立克病毒载体疫苗株，以tk启动子作为传染性喉气管炎病毒的gd蛋白的启动元件，以hsvtk polya作为终止子，构建得到gd基因表达盒，通过将gd基因表达盒插入作为载体的i型mdv sc9-1基因组的ul3/4或ul45/46位点，构建得到表达传染性喉气管炎病毒gd蛋白的重组马立克病毒载体疫苗株。

3、作为优选，tk启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示，hsv tk polya的核苷酸序列如seq id no：2所示，gd基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。

4、作为优选，gd蛋白的氨基酸序列如seq id no：4所示。

5、作为优选，所述重组马立克病毒载体疫苗株为弱毒活载体疫苗。

6、本发明提供了一种根据上述任一项技术方案所述的重组马立克病毒载体疫苗株在制备用于同时攻毒防护鸡传染性喉气管炎病毒和马立克氏病病毒的药剂中的用途。

7、本发明提供了一种根据上述任一项技术方案所述的重组马立克病毒载体疫苗株在制备用于预防动物同时受鸡传染性喉气管炎病毒和马立克氏病病毒感染的药剂中的用途。

8、作为优选，所述重组马立克病毒载体疫苗株通过颈部皮下接种方式免疫，免疫剂量为3000pfu/0.2ml。

9、作为优选，免疫后28天，通过气管内注射方式攻毒传染性喉气管炎病毒强毒株王岗毒株，每只鸡攻毒104.0eid50/0.2ml，保护率达到100％。

10、作为优选，免疫后6天，通过腹腔注射方式攻毒马立克病毒超强毒株md5，每只鸡攻毒1000pfu/0.2ml，保护率达到100％。

11、本发明提供了一种diva疫苗，采用上述任一项技术方案所述的重组马立克病毒载体疫苗株制备得到。

12、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

13、1、本发明成功筛选出了tk启动子及其gd蛋白表达盒，筛选出了可稳定、高效表达外源蛋白的ul3/4和ul45/46位点，开发出了针对iltv和mdv均能提供100％保护并且对雏鸡绝对安全的活载体疫苗株。该载体疫苗株使用sc9-1弱毒株为载体表达iltv的gd蛋白，可以完美的规避上述iltv活疫苗带来的安全风险。

14、2、本发明构建的载体疫苗只含有iltv的gd蛋白，配合iltv gb蛋白抗体检测试剂盒，即可实现野毒感染或减毒活疫苗免疫与活载体疫苗免疫的区分，有利于随时对iltv的感染情况进行监测以及实现针对iltv的种群净化。

15、3、与常规疫苗相比，本发明筛选的重组病毒活载体疫苗还具有以下优点：(1)可同时启动机体细胞免疫和体液免疫，避免了灭活疫苗和亚单位疫苗的免疫缺陷，同时克服了iltv活疫苗的副反应和毒力返强；(2)可同时构成二联疫苗：既能降低生产成本，又能简化免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗间产生的干扰现象，能同时防控鸡传染性喉气管炎和鸡马立克氏病；(3)疫苗用量少，免疫保护持续时间长、效果好，不须添加佐剂，降低了养殖成本。