一种荧光与条形码谱系追踪的肺泡类器官及其构建方法和应用

本发明涉及生物领域，特别是涉及一种荧光与条形码谱系追踪的肺泡类器官及其构建方法和应用。

背景技术：

1、慢性阻塞性肺疾病(copd)是一种常见的慢性呼吸道疾病，主要表现为气道阻塞和肺组织破坏，其主要病理特征为肺泡上皮细胞的损伤和重构，其特征是不可逆的呼吸气流受限，且随着时间推移而恶化。copd是全球第三大死因，也是全球慢性残疾和死亡的主要原因。copd的发病率和死亡率较高，给患者自身、家人和社会带来沉重的经济负担。由于全球环境持续恶化和人口老龄化，copd的负担将在未来几十年内逐渐增加。copd的发病机制十分复杂，包括氧化应激、炎症、蛋白酶-抗蛋白酶失衡和细胞凋亡等。

2、copd主要的病理特征包括：慢性肺部炎症，气道重塑，肺气肿和肺功能受损。慢性肺部炎症表现为各级支气管壁的炎症细胞浸润。气道重塑主要由于气道平滑肌细胞增生，成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，伴有细胞外基质沉积。肺气肿的病理表现为肺泡间隙增大和破裂以及弹性纤维网络的破坏，作为copd的主要病理特征，肺气肿一直是copd研究的重点。copd是一种可预防和治疗的疾病，但由于对其病因和发病机制尚不明确，目前并没有方法可以有效阻止copd的发生或进展。

3、可靠的体外模型可以有效缩短copd的发病机制以及治疗方法的探究，然而现有的体外模型难以准确模拟人类肺部的微环境和细胞行为。肺泡ii型(at2)细胞的再生和修复机制是肺部疾病的重要研究方向，但现有技术在分选at2细胞和研究其谱系重溯方面存在一定局限性。传统方法难以同时实现对at2细胞的特异性分选和动态追踪，限制了对疾病进程中at2细胞谱系再生修复异常的系统性研究。因此，有必要寻找一种能够对at2细胞的特异性分选和动态追踪的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种荧光与条形码谱系追踪的肺泡类器官及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明开发一种携带at2细胞谱系特异荧光标记条形码的肺泡类器官，能够模拟肺泡组织的结构特性，结合荧光谱系追踪和条形码技术，可以在体外条件下精确追踪at2细胞的命运和功能变化，为copd研究提供了新的研究工具。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种荧光与条形码谱系追踪的肺泡类器官的构建方法，包括以下步骤：

4、将spc-cre ert2工具小鼠和r26r tdtomato报告小鼠交配，获得报告小鼠；

5、将所述报告小鼠互配后，获得spc-cre ert2+/-，r26rtdtomato+/+谱系追踪小鼠；

6、将rtta工具小鼠与hmf9-barcode小鼠交配，获得携带rtta/hmf9的条形码谱系追踪小鼠；

7、将所述spc-cre ert2+/-，r26r tdtomato+/+谱系追踪小鼠和所述携带rtta/hmf9的条形码谱系追踪小鼠交配后，得到spc-cre ert2，r26r tdtomato，rtta，hmf9-barcode杂合双标记谱系追踪小鼠；

8、取spc-cre ert2，r26r tdtomato，rtta，hmf9-barcode杂合双标记谱系追踪小鼠的肺部组织，分离肺泡ii型细胞，并培养，得到所述肺泡类器官；

9、所述培养采用的培养基以advance dmem/f12培养基为基础培养基，还包括1×b27、1×青霉素-链霉素、5-10μm y-27632、2-5μm chir-99021、10μm sb-431542、1μmbirb796、10ng/mlnoggin、50ng/ml egf、10ng/ml fgf-7、10ng/ml fgf-10、10ng/mlrspondin-1和50ng/mlnrg 1。

10、进一步优选的，所述培养采用的培养基以advance dmem/f12培养基为基础培养基，还包括1×b27、1×青霉素-链霉素、10μmy-27632、3μm chir-99021、10μm sb-431542、1μmbirb796、10ng/ml noggin、50ng/ml egf、10ng/ml fgf-7、10ng/ml fgf-10、10ng/mlrspondin-1和50ng/mlnrg 1。

11、进一步优选的，所述取spc-cre ert2，r26r tdtomato，rtta，hmf9-barcode杂合双标记谱系追踪小鼠的肺部组织时，要尽量去除非肺组织(如：气管、粘膜)，并将肺组织剪碎至匀浆状。

12、优选的，所述分离肺泡ii型细胞包括对所述肺部组织进行消化、离心、过滤、裂红和分选的步骤。

13、优选的，所述消化采用的消化酶包括2mg/ml组织胶原酶ⅰ、5mg/ml分散酶、0.01mg/ml dna酶和3mldmem-f12培养基；

14、所述消化的温度为36.5℃-37.5℃，时间为30-40min。

15、进一步优选的，所述消化过程中，每隔10-15min对肺组织进行吹打，可有效增加裂解效率。

16、优选的，所述离心的条件参数为：500rcf离心10min；

17、所述裂红的条件参数为：4℃孵育5min。

18、优选的，所述分选的方法包括磁珠分选法和流式分选法。

19、本发明提供了利用上述的构建方法构建得到的肺泡类器官。

20、本发明提供了上述的肺泡类器官在筛选或制备预防或治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

21、本发明提供了一种诱导上述的肺泡类器官谱系荧光与条形码突变的方法，利用他莫昔芬和多西环素诱导培养所述肺泡类器官；

22、所述他莫昔芬的浓度为250nm-500nm，诱导培养的时间为24-48h；

23、所述多西环素的浓度为1μg/ml，诱导培养的时间为10d。

24、本发明提供了一种用于培养肺泡类器官的培养基，所述培养基以advance dmem/f12培养基为基础培养基，还包括1×b27、1×青霉素-链霉素、5-10μmy-27632、2-5μm chir-99021、10μm sb-431542、1μm birb796、10ng/mlnoggin、50ng/ml egf、10ng/mlfgf-7、10ng/ml fgf-10、10ng/mlrspondin-1和50ng/mlnrg 1。

25、进一步优选的，所述培养采用的培养基以advance dmem/f12培养基为基础培养基，还包括1×b27、1×青霉素-链霉素、10μmy-27632、3μm chir-99021、10μm sb-431542、1μmbirb796、10ng/ml noggin、50ng/ml egf、10ng/ml fgf-7、10ng/ml fgf-10、10ng/mlrspondin-1和50ng/mlnrg 1。

26、本发明提供了上述的培养基在培养肺泡类器官中的应用。

27、本发明公开了以下技术效果：

28、1.利用spc-tdtomato荧光标记特异性分选出at2谱系，提高分选效率和准确性。

29、2.利用本发明构建方法获得的肺泡类器官在他莫昔芬诱导下，可在体外观察at2的分化谱系；在多西环素的诱导下，条形码可进行突变累计，进行细胞谱系追踪，为疾病机制探究提供可靠平台。

30、3.降低实验成本：使用类器官模型进行疾病机制探讨，具有可重复性，可靠性，避免动物实验昂贵，试验周期长的缺点。

31、4.本发明还优化了小鼠肺泡类器官的培养基方案，使类器官的形成效率更高。

32、综上可知，本发明特别是针对at2细胞的特异性分选与类器官的培养和疾病进程中的谱系重溯问题，并用于模拟和研究copd的体外病理过程这一情况，通过荧光谱系追踪技术结合条形码分析技术，构建得到了一种荧光与条形码谱系追踪的肺泡类器官，该类器官可以在疾病模型中追踪肺泡ii型细胞(at2)的命运转变，进一步解码细胞谱系，从而为copd的早期诊断和治疗提供新的研究依据。