一种含有脂肪酸化修饰的SpyCatcher蛋白的免疫组合物及其制备方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含有脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的免疫组合物及其制备方法。

背景技术：

1、目前授权上市的疫苗主要有减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗等，然而基于全病原体的疫苗具有诸多安全性隐患和无效免疫反应问题。随着对病原体的生活周期、遗传特点、致病机理等的深入研究，疫苗抗原的选择和设计从全病原体抗原过渡到某一种或几种明确的保护性组分，由此进入亚单位疫苗时代。一款成功的疫苗在保证安全性的前提下必须能够诱导针对病原体的特异性免疫保护作用，亚单位疫苗安全性优异，但免疫原性较弱，抗原易被清除，因此选择合适的抗原及抗原设计方案、免疫刺激物和抗原递送系统是亚单位疫苗成功的关键因素。

2、spytag/spycatcher连接系统是研究最为深入的蛋白连接系统之一，此系统因反应迅速、特异、对反应条件宽泛、反应不可逆等优点广泛用于疫苗开发与研究，将其分别与病原体抗原、合适的载体蛋白融合表达，可以实现抗原与载体蛋白的精准共价连接，特别是可实现抗原在自聚合纳米载体蛋白表面重复展示，提高了抗原的提呈效率和免疫原性。此连接系统源于酿脓链球菌（streptococcus pyogenes）的纤连蛋白结合蛋白（fibronectin-binding protein）的cnab2结构域，cnab2结构域的lys31和asp117可形成分子内异肽键，将cnab2结构域拆分为含有lys31的n端结构域（spycatcher, 116aa）和含有asp117的c末端多肽（spytag, 13aa）后，两个片段依然可形成特异的异肽键。为了进一步优化spytag/spycatcher连接系统，mark howarth团队分析了其结构与功能之间的关系，证明了能够形成异肽键所需的最小spycatcher；为了提高连接反应速度和效率，该团队对spytag（13aa）/spycatcher（116aa）连接系统进行人工设计，开发出spytag002/spycatcher002和spytag003/spycatcher003连接系统，这些截短和突变的spycatcher系统均具有类似的异肽键连接功能，本发明所述spycatcher均包括这些spycatcher变异体。

3、细菌中存在一类n末端半胱氨酸（cys）被脂肪酸化修饰并通过脂肪酸链固定在细胞表面的蛋白，称为细菌脂蛋白。细菌脂蛋白的体内合成是在信号肽的引导下完成的，对细菌天然脂肪酸化修饰和非脂肪酸化修饰蛋白的信号肽序列进行生物信息学和统计学分析，发现脂肪酸化修饰蛋白的信号肽在临近信号肽酶切割位点为非极性氨基酸，并具有一定的保守性，归纳总结发现这一区域最后四位氨基酸的保守序列为[l/v/i][a/s/t/v/i][g/a/s][c]，其中c末端的半胱氨酸是脂化修饰位点。在信号肽的引导下，新生肽链经sec或tat分泌途径分定位至细胞膜外侧，lgt酶以磷脂酰甘油（pg，phosphatidylglycerol）为底物，将二酰基甘油连接至cys的巯基上，lspa酶切除信号肽除c端cys外的部分，lnt酶以磷脂酰乙醇胺（pe）为底物将一条脂肪酸链转移至cys的alpha-氨基上。细菌脂肪酸化修饰是不均一的，主要表现在脂肪酸链的数量、脂肪酸链的长度等方面，细菌脂蛋白的脂酰基碳链长度通常在c14-c18之间，但绝大多数脂酰基碳链长度为c16。

4、冠状病毒是一类具有包膜的单正链rna病毒，属于冠状病毒科，已知可感染人类的冠状病毒共有7种，目前可导致严重疾病甚至死亡的是sars-cov、sars-cov-2和mers-cov。冠状病毒的主要结构蛋白包括刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(n)，其中s蛋白位于冠状病毒包膜表面，可识别宿主细胞受体并通过构象改变介导病毒与宿主细胞的膜融合。例如，sars-cov和sars-cov-2的受体是血管紧张素转化酶2（ace2,angiotensin converting enzyme 2)，mers-cov的受体是二肽基肽酶-4（dpp4,dipeptidyl peptidase 4）。在s蛋白中，rbd（receptor-binding domain）作为独立的结构域具有与受体结合的能力，由于rna病毒复制过程缺乏矫正机制，编码蛋白持续变异，在选择压力的筛选下，各种突变株的rbd依然保持与受体特异性结合的能力。例如sars-cov-2病毒自出现以来，被世界卫生组织认定为需要关注的变异株（variant of concern，voc）就有阿尔法（alpha）、贝塔（beta）、伽玛（gamma）、德尔塔（delta）和奥密克戎（omicron）五大类，未来各种变异株还将不断出现。rbd是s蛋白的免疫优势区，包含绝大多数的中和表位，是理想的候选抗原，开发基于rbd的疫苗利于免疫聚焦，特别是开发基于rbd的黏膜亚单位疫苗可诱导特异性的黏膜免疫反应及siga的产生，有望在呼吸道黏膜部位第一时间阻断突变病毒的感染与扩散。然而，rbd分子量较小、免疫原性相对较低，阻碍了以rbd为抗原的亚单位疫苗开发，以rbd为抗原的黏膜疫苗更是难上加难。

5、肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae），简称mp，是自然界最小且能独立生存的微生物，是引起住院患儿肺炎的主要病原体之一。肺炎支原体感染是通过飞沫经呼吸道传播，气管支气管炎是最常见的下呼吸道感染类型，有大概10%-40%会发展为肺炎，小部分病例还会发展为重症肺炎和难治性肺炎，由肺炎支原体感染引起的肺炎是社区获得性肺炎最常见的病因。肺炎支原体无细胞壁，其致病机制主要依靠细胞黏附作用，其通过特异性附着细胞器在呼吸道中定植，从而引起细胞的损伤，发挥黏附作用的蛋白主要是p1蛋白和p40/90蛋白。因此，p1蛋白和/或p40/90蛋白是肺炎支原体亚单位疫苗的候选抗原，开发基于p1蛋白和/或p40/90蛋白的黏膜亚单位疫苗可诱导特异性的黏膜免疫反应及siga的产生，有望在呼吸道黏膜部位第一时间阻断支原体的黏附与扩散。

6、在现有的技术方案中，将保护性抗原展示在蛋白纳米颗粒表面、和/或物理混合或包埋佐剂、利用减毒病毒载体或细菌载体递送抗原是提高抗原黏膜递送效率并提高免疫原性的有效手段，然而载体带来的预存免疫问题、免疫聚焦失衡问题、佐剂和辅料剂带来的安全性问题困扰着黏膜疫苗的开发。因此有必要开发一种新的策略，在提高抗原免疫原性的同时，既降低载体蛋白免疫印记效应和/或免疫优势，又能够降低佐剂带来的副反应。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种含有脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的免疫组合物及其制备方法。

2、依据本发明技术方案的第一方面，本发明提供一种脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白。

3、所述的脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白特征为含有脂肪酸化修饰的n-末端半胱氨酸（cys）。

4、在某些实施例中，所述脂肪酸化修饰的n-末端半胱氨酸（cys）具体为cys的巯基被二脂酰基甘油修饰，或cys的巯基被二脂酰基甘油修饰且α-氨基被脂酰基修饰。

5、所述脂酰基碳链长度为c16~c18。

6、所述spycatcher蛋白为包括如seq id no.1-3之任一所示的氨基酸序列的多肽。

7、依据本发明技术方案的第二方面，本发明提供一种含有上述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的免疫组合物。

8、在某些实施例中，所述免疫组合物还包含与spytag多肽融合表达的抗原。

9、在某些实施例中，所述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白与所述与spytag多肽融合表达的抗原通过异肽键共价连接。

10、在某些实施例中，所述spytag多肽的氨基酸序列如seq id no.10-12之任一所示的氨基酸序列的多肽。

11、当所述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白包含seq id no.1所示的spycatcher蛋白时，需选用seq id no.10所示的spytag多肽；当所述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白包含seq id no.2所示的spycatcher蛋白时，需选用seq id no.11所示的spytag多肽；当所述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白包含seq id no.3所示的spycatcher蛋白时，需选用seq idno.12所示的spytag多肽。

12、在某些实施例中，所述与spytag多肽融合表达的抗原为呼吸道病毒抗原。

13、在某些实施例中，所述呼吸道病毒抗原包括冠状病毒抗原。

14、在某些实施例中，所述冠状病毒包括sars-cov-2、sars-cov、mers-cov。

15、在某些实施例中，所述冠状病毒抗原包括刺突蛋白（s蛋白）和/或其功能性片段。

16、在某些实施例中，所述s蛋白功能性片段优选的为受体结合域（rbd）。

17、在某些实施例中，所述sars-cov-2 rbd包括sars-cov-2 s蛋白原型及其各种变异体中能与ace2受体结合的结构域。

18、在某些实施例中，所述sars-cov s蛋白rbd包括sars-cov s蛋白原型及其各种变异体中能与ace2受体结合的结构域。

19、在某些实施例中，所述mers-cov s蛋白rbd包括mers-cov s蛋白原型及其各种变异体中能与dpp4受体结合的结构域。

20、在某些实施例中，rbd氨基酸序列如seq id no.13-21之任一所示。

21、在某些实施例中，所述与spytag多肽融合表达的抗原为支原体蛋白抗原。

22、在某些实施例中，所述支原体蛋白抗原具体为肺炎支原体p1蛋白或其部分片段、或p40/p90蛋白或其部分片段。

23、在某些实施例中，所述肺炎支原体p1蛋白的氨基酸序列如seq id no.31所示。

24、在某些实施例中，肺炎支原体p40/p90蛋白的氨基酸序列如seq id no.32所示。

25、依据本发明技术方案的第三方面，本发明提供一种如上述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的制备方法，所述制备方法包含以下步骤：

26、1）将含有信号肽编码序列、spycatcher蛋白编码序列的dna片段导入到大肠杆菌，培养重组大肠杆菌表达脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白；

27、2）培养步骤1）所述的重组大肠杆菌，收获菌体并裂解，加入适当的表面活性剂从裂解液中提取并纯化脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白。

28、在某些实施例中，所述信号肽，其氨基酸序列如seq id no.4-6之任一所示。

29、所述含有信号肽编码序列、spycatcher蛋白编码序列的dna片段可以通过表达质粒导入到大肠杆菌，也可以整合进入大肠杆菌基因组。

30、在某些实施例中，所述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的氨基酸序列如seq idno.36所示；为了方便蛋白质纯化，可以加入纯化标签，例如his标签，含有his标签的脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的氨基酸序列如seq id no.35所示。

31、依据本发明技术方案的第四方面，提供一种含有上述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的免疫组合物的制备方法，所述制备方法包含以下步骤：将上述所述脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白和上述所述的与spytag多肽融合表达的抗原按照一定的比例混合，在适合的条件下充分反应获得免疫组合物。

32、依据本发明技术方案的第五方面，本发明提供如上述免疫组合物在制备能引起动物产生抗原特异性抗体的产品中的应用，所述免疫组合物可以通过肌肉注射、或皮下注射、或通过滴鼻免疫、或雾化免疫。

33、在某些实施例中，所述产品为疫苗。

34、依据本发明技术方案的第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物，包含上述的脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白。

35、依据本发明技术方案的第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物，包含编码上述的脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的核酸。

36、依据本发明技术方案的第八方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物，包含编码上述的脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的载体。

37、依据本发明技术方案的第九方面，本发明提供生物材料，所述生物材料为下述任一种：

38、c1)编码上述的脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白的核酸分子；

39、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

40、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

41、c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

42、c5)含有c1)所述核酸分子的重组细胞、或含有c2)所述表达盒的重组细胞、或含有c3)所述重组载体的重组细胞。

43、本发明与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

44、本发明公开的含有脂肪酸化修饰的spycatcher蛋白以及冠状病毒rbd抗原的免疫组合物可诱导强烈的rbd特异性免疫反应，特别是作为黏膜亚单位疫苗，可诱导抗原特异性的黏膜免疫和体液免疫，为阻断病原体在感染位点的侵入与扩散传播奠定基础。本发明还进一步提供了一种在大肠杆菌中用异源信号肽引导spycatcher蛋白完成脂肪酸化修饰的方法，及用该脂肪酸化修饰蛋白的制备各种免疫组合物的方法。