一种稳定、高效且环境友好的银纳米颗粒乳酸菌生物合成方法及应用

本发明属于微生物应用，具体涉及一种稳定、高效且环境友好的银纳米颗粒乳酸菌生物合成方法及应用。

背景技术：

1、银纳米颗粒(agnps)由于其独特的物理和化学特性，包括抗菌、抗癌、抗病毒和药物递送等，已被确定为生物医学和生物应用中最有前途的纳米颗粒之一。近年来，银纳米颗粒因其强大的杀菌能力而备受关注。银离子可以与细菌的蛋白质和dna结合，阻止细胞代谢和分裂，从而起到杀菌的效果。此外，银离子还可以破坏病毒和真菌的细胞壁，防止感染的扩散。然而，传统合成方法生产成本高，还会产生造成环境污染的危险废物，因此采用微生物合成agnps的工艺作为常规方法的替代方案受到了相当大的关注。乳酸菌是革兰氏阳性非致病菌，广泛存在于牛奶和发酵食品中，同时具有促进健康的益生菌特性，可供人类和动物安全食用。有研究表明，乳酸菌是agnps生产的一种有前途的还原剂。使用乳酸菌上清液作为合成agnps的还原剂已获得成功，通过处理细菌上清液，agnps合成工艺中下游处理将变得更加直接和轻松。在生产agnps的各种研究中，乳酸菌已被用作还原剂和封端剂。然而，关于乳酸菌硝酸盐还原酶作用的深入研究尚未报道。目前使用乳酸菌生物合成agnps的研究还较少，工艺过程存在纯化复杂、转化效率低、产率不稳定、能耗高、成本较高等缺点，对乳酸菌细胞作为纳米工厂的潜力还需进一步研究和优化。因此，需要更多的研究来优化反应条件并提高纳米颗粒生物合成的产量和速率。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明旨在建立一种稳定、高效且环境友好的银纳米颗粒乳酸菌生物合成方法，并改良复合抗菌包装，应用于冷鲜肉的保鲜，以提高食品安全保障。

2、本发明进行硝酸盐还原试验以确定菌株将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力，从6株乳酸菌筛选出优化菌株；使用响应面法优化用于硝酸盐还原酶生产的培养基成分，优化合成条件；乳酸菌存在多种代谢产物，可将ag离子还原成agnps，还可覆盖并防止结块进而降低毒性。最终开发出一种稳定、高效、环保的乳酸菌agnps生物合成方法。

3、应用于食品工业的不同类型和形状的纳米颗粒必须了解与食品基质以及与微生物的相互作用。本发明对乳酸菌生物合成的agnps进行表征，并评估其对致病菌和腐败菌的抗菌活性及在食品包装中的应用价值。开发出阐明抗菌机制的研究方法，对agnps作用致病菌和腐败菌是抑制作用还是杀菌作用进行深入探讨，剖析引起细菌细胞膜破裂和细胞溶解蛋白质泄漏的相互作用机制，进一步研究复合agnps的新型抑菌食品包装材料的方法。

4、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

5、一种稳定、高效且环境友好的银纳米颗粒的乳酸菌生物合成方法，包括以下步骤：

6、(1)进行硝酸盐还原试验以确定菌株将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力，从6株乳酸菌菌株中筛选出优化菌株；

7、(2)使用响应面法优化用于硝酸盐还原酶生产的培养基成分，优化合成条件；

8、(3)利用步骤(1)筛选出的优化菌株合成银纳米颗粒。

9、进一步，所述步骤(1)中，优化菌株的筛选方法如下：

10、对6株乳酸菌菌株的硝酸盐还原酶活性进行检测，空白组做对照，进行硝酸盐还原试验以确定微生物将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力，乳酸菌在mrs-硝酸盐培养基中37℃培养24h，将100μl硝酸盐试剂a和100μl硝酸盐试剂b依次加入培养物中，记录发生的颜色变化；

11、将具有硝酸盐还原酶活性的乳酸菌菌株在37℃的mrs-硝酸盐培养基中生长24h，摇匀后分别用移液枪抽取培养物1.5ml于离心管中，在4℃下以10000rpm离心20min，使用0.45μm膜过滤器过滤上清液，得到的无细胞上清液作为粗酶，将1.8ml硝酸盐还原酶底物溶液加入100μl粗酶中，再加入100μl 2.0mmβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原溶液(β-nadh)进行反应；将反应混合物在30℃下无光孵育1h后加入1ml 58mm磺胺溶液，然后加入1ml 0.77mmn-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(ned)溶液终止反应，于25℃保持20min得到淡紫色溶液，使用紫外-可见分光光度计在波长540nm处测量溶液的吸光度值，并记录；

12、所述6株乳酸菌菌株为植物乳杆菌、乳酸乳球菌亚种、德氏乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌。

13、进一步，硝酸盐试剂a配制方法如下：配制250ml磺胺酸溶液需要称取1.25g的磺胺，加入装有适量5n乙酸的250ml容量瓶内，加入5n乙酸进行定容，盖上塞子充分摇匀。

14、进一步，硝酸盐试剂b(n，n-二甲基-1-萘胺溶液)配制方法如下：配制250ml n，n-二甲基-1-萘胺溶液需要量取1.5ml的磺胺，加入装有适量5n乙酸的250ml容量瓶内，加入5n乙酸进行定容，盖上塞子充分摇匀。

15、进一步，硝酸盐还原酶底物溶液配制方法如下：配制500ml的硝酸盐还原酶底物溶液，称取磷酸钾2.65g，硝酸钾0.5g，乙二胺四乙酸0.0043g，将这些试剂加入盛有少量蒸馏水的容量瓶中(500ml)，加入蒸馏水定容到500ml，盖上盖子充分摇匀。

16、进一步，2.0mmβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原溶液(β-nadh)配制方法如下：配制500ml2.0 mmβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原溶液需要称取0.742gβ-nadh，将β-nadh加到盛有少量蒸馏水的容量瓶中(500ml)，加入蒸馏水定容到500ml，盖上盖子充分摇匀。

17、进一步，58mm磺胺溶液配制方法如下：配制58mm磺胺溶液需要称取5g磺胺，将磺胺加到盛有少量蒸馏水的容量瓶中(500ml)，加入蒸馏水定容到500ml，盖上盖子充分摇匀。

18、进一步，0.77mm n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(ned)溶液配制方法如下：配制0.77mm n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(ned)溶液需要称取0.1g n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐，将n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐加到盛有少量蒸馏水的容量瓶中(500ml)，加入蒸馏水定容到500ml，盖上盖子充分摇匀。

19、进一步，所述步骤(1)中，从6株乳酸菌筛选出硝酸盐还原酶活性的能力最佳生产菌株是植物乳杆菌lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum cicc 20022，硝酸还原酶活性达27.53u/ml。

20、进一步，所述步骤(2)中，使用响应面法优化用于硝酸盐还原酶生产的培养基成分，优化合成条件，优化后的mrs-硝酸盐培养基的组成为：蛋白胨10.0g/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母膏5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖8.5g/l，吐温80 1.0ml/l，硝酸钾22.8g/l，蒸馏水1000ml，调至ph＝4.85。

21、进一步，植物乳杆菌在优化后的mrs-硝酸盐培养基中37℃培养24h；1.5ml发酵液4℃10000rpm离心20min，使用0.45μm膜过滤器过滤上清液，得到的无细胞上清液作为粗酶，将1.8ml硝酸盐还原酶底物溶液加入100μl粗酶中，再加入100μl 2.0mmβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原溶液(β-nadh)进行反应；将反应混合物在30℃下无光孵育1h后加入1ml58mm磺胺溶液，然后加入1ml0.77mm n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(ned)溶液终止反应，于25℃保持20min得到淡紫色溶液；使用紫外-可见分光光度计在波长540nm处测量植物乳杆菌的硝酸还原酶活性成功地从33.53u/ml增加到39.13u/ml，提高了16.7％。

22、进一步，步骤(3)合成银纳米颗粒的方法为：甘油保藏的植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum cicc 20022)从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台上用移液枪吸取200μl接种于5ml灭菌后的mrs液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h，然后以5％的接种量进行传代，使得菌株活化两次；将活化两次的植物乳杆菌菌液5ml接种于优化后的mrs-硝酸盐培养基中37℃培养24h后，4℃、10000rpm离心20min得无细胞上清液，加入agno3水溶液，使混合溶液银离子(ag+)浓度为1mm；将混合溶液在25℃下避光孵育过夜，25℃10000rpm离心10min除去多余的上清液和未反应的ag，沉淀无菌水洗涤两次后25℃10000rpm离心5min收集生物合成的agnps，将沉淀烘干水分，得到粉末状的agnps。

23、所述优化后的mrs-硝酸盐培养基的组成为：蛋白胨10.0g/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母膏5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖8.5g/l，吐温80 1.0ml/l，硝酸钾22.8g/l，蒸馏水1000ml，调至ph＝4.85。

24、进一步，使用傅里叶红外光谱仪测定agnps的吸收光谱为430nm，扫描电子显微镜观察生物合成的银纳米颗粒agnps是球形，平均直径为98.2±4.8nm，颗粒均匀。

25、本发明还提供利用所述的乳酸菌生物合成方法制得的银纳米颗粒在抑菌包装材料中的应用：超净工作台中pe和pla若干紫外照射1h杀菌，取重悬于无菌水中的40mg/l银纳米颗粒(agnps)溶液20ml装入无菌喷壶内，均匀喷洒于pe或pla保鲜袋内侧，等待其表面自然干燥，并再次进行喷涂以增加银纳米颗粒的附着量和均匀性，第二次喷涂干燥完成后即完成纳米银抑菌包装材料的制备。

26、进一步，agnps作为抑菌剂用于改良pe、pla食品包装材料保鲜鸡胸肉，抑菌效果可分别提高41.9％、42.5％。

27、本发明的有益效果：

28、本发明建立了一种银纳米颗粒乳酸菌生物合成方法，并改良复合抗菌包装成功延长了冷鲜肉的保鲜期。区别于已有的对银纳米颗粒乳酸菌的合成制备，更加高效稳定且环境友好。利用这种合成方法改良复合抗菌包装延长冷鲜肉的保鲜期有助于食品安全的实现。本发明中对6株乳酸菌的抑菌性和硝盐还原能力进行定性和定量分析，确定植物乳酸杆菌为最佳生产菌。响应面法优化乳酸菌纳米银合成条件为0.85％葡萄糖、2.28％kno3、ph4.85(对应的优化后的mrs-硝酸盐培养基的组成)，培养24h后由于ag+还原和表面等离子体共振激发有棕色产生，硝酸还原酶活性可达39.13u/ml，合成率比优化前提高16.7％。

29、对纳米银颗粒进行表征，傅里叶红外光谱分析表明，植物乳杆菌合成的agnps在430nm处呈峰，通过扫描电镜分析agnps颗粒呈球形且颗粒均匀，平均直径为98.2±4.8nm。进一步分析抑菌谱发现agnps对革兰氏阴性菌表现出抗菌活性，但对于革兰氏阳性菌作用不明显。agnps作为抑菌剂用于改良pe、pla食品包装材料保鲜鸡胸肉，抑菌效果可分别提高41.9％、42.5％。

30、与物理和化学方法相比，agnps的乳酸菌合成具有成本效益、环境友好、对人体细胞低毒性、易于大规模生产、无需使用危险化学品和高温高压等优点。利用乳酸菌合成的agnps相对其他细菌表现出更强的抗菌活性。本发明利用乳酸菌生物合成银纳米颗粒提供了一种高效、稳定且环境友好的方法，改进抗菌包装材料是 针对冷鲜肉腐败微生物控制的一项关键策略和方法，为科学系统、高效实用地保障肉品安全提供了强有力的技术支撑。

31、本发明开发一种稳定、高效且环境友好的银纳米颗粒乳酸菌生物合成方法，具有较高的技术含量和推广应用价值，表现在：1、利用植物乳杆菌合成的agnps对人体细胞低毒性、易于大规模生产、无需使用危险化学品和高温高压等优点，相对其他细菌表现出更强的抗菌活性；2、合成成本低，对环境友好，不会产生污染；3、由植物乳杆菌合成银纳米颗粒对多种致病菌和腐败菌具有杀灭作用，开发适用于冷鲜肉的环保银纳米天然抗菌剂，以增强食品安全性或延长食品保质期，可有效提高食品安全。