一种重组III型人源化胶原蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种重组iii型人源化胶原蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

1、胶原蛋白(collagen)是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，存在于皮肤、骨骼、肌腱、软骨和血管等多种组织中。常见的胶原蛋白有i型、iii型、xvii型等，iii型胶原蛋白是由三条相同的多肽α链螺旋缠绕形成的三股螺旋结构，具有高度保守的氨基酸序列，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸在特定位置重复出现，形成了独特的三维结构，与i型胶原蛋白一起形成了皮肤的基底膜，为其提供强度和弹性支撑。胶原蛋白具有固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性、促新细胞形成及促上皮细胞形成等功能，在医学领域、美容、化妆品、保健品行业具有巨大的应用前景。

2、重组技术的发展使iii型胶原蛋白可以在无需使用动物源的情况下进行高纯度和高特异性生产。重组iii型胶原蛋白是利用基因工程技术，将人胶原iii型原始基因序列经优化重组表达得到的，克服了利用传统方法提取的胶原蛋白生物活性低、溶解性差、生物利用率低，容易引起免疫反应和过敏等一系列问题。

3、专利文献cn114085284a公开了一种重组iii型人源化胶原蛋白、核酸、载体及植入剂。该重组iii型人源化胶原蛋白是选取天然人iii型胶原蛋白α1链中经长期筛选获得的稳定性佳的序列肽段549-560aa、597-613aa、881-902aa、648-662aa，将四段肽链按顺序拼接组成单体，然后对单体进行串联表达。经发酵纯化，所获得的重组iii型人源化胶原蛋白稳定性高，有效地解决了重组iii型人源化胶原蛋白在临床使用过程中降解的问题，可制备成液体制剂保存和使用。

4、专利文献cn116987176a公开了一种重组iii型人源化胶原蛋白及其应用。该重组iii型人源化胶原蛋白是以一段水溶性好、具有细胞黏附片段、具有非羟脯氨酸依赖的三螺旋区段、具有半胱氨酸稳定性区段的序列为目标序列，并将该目标序列在重复1～10组合。该重组iii型人源化胶原蛋白在结构上与人iii型胶原序列对应区段100％相同，应用于人体中不会产生免疫排斥。

5、专利文献cn118773255a公开了一种重组全长iii型人源化胶原蛋白的制备方法及应用。该重组全长iii型人源化胶原蛋白是将人iii型胶原蛋白α1链成熟肽氨基酸全长序列通过基因工程密码子序列优化与表达载体合成后，转入hek293f宿主细胞进行重组表达，获得分泌高表达菌株或细胞株，产物经纯化后获得重组全长iii型人源化胶原蛋白。制得的重组胶原蛋白在修复与再生医学、医学美容填充材料以及功能性化妆品材料中具有广泛应用潜力。

6、然而，目前采用基因工程方法制备的重组胶原蛋白仍然存有表达量低、溶解度不高、重组胶原蛋白活性低或易降解等问题。因此，研究和开发出一种胶原蛋白结构稳定、抗降解性高、亲水性好和生物活性高的iii型胶原蛋白仍是目前亟需解决的难点。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的重组iii型人源化胶原蛋白。本发明采用先进的ai技术和分子动力学模拟，设计了一种新的iii型人源化胶原蛋白序列，确保了重组iii型人源化胶原蛋白产品具备高稳定性和抗降解性。本发明将筛选后的新的iii型人源化胶原蛋白序列转到毕赤酵母菌株进行重组表达，制得的重组iii型人源化胶原蛋白具有稳定性强、表达量高和亲水性好的优点，同时，该重组iii型人源化胶原蛋白还具有显著的促进细胞增殖和细胞黏附的作用。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、本发明提供了一种重组iii型人源化胶原蛋白，所述重组iii型人源化胶原蛋白由串联重复的单体和尾部拼接氨基酸序列如seq id no:4所示的氨基酸肽组成，所述单体由seq id no:1所示的氨基酸肽和seq id no:2所示的氨基酸肽按顺序拼接而成，所述单体的串联个数为10。

4、进一步地，所述单体的氨基酸序列如seq id no:3所示。

5、进一步地，所述重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。

6、进一步地，本发明提供了一种重组iii型人源化胶原蛋白的编码基因，所述重组iii型人源化胶原蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no:6所示。

7、进一步地，本发明提供了一种重组iii型人源化胶原蛋白重组载体，所述重组载体包含上述重组iii型人源化胶原蛋白的编码基因。

8、进一步地，本发明还提供了一种工程菌株，所述工程菌株包含上述重组iii型人源化胶原蛋白的编码基因或上述重组iii型人源化胶原蛋白重组载体。

9、另外，本发明还提供了所述重组iii型人源化胶原蛋白在制备化妆品或医疗器械类产品中的应用。

10、进一步地，所述重组iii型人源化胶原蛋白在制备抗衰老类化妆品、修复类化妆品或抗氧化类化妆品中的应用。

11、进一步地，所述重组iii型人源化胶原蛋白在制备具有促进细胞增殖、黏附和迁移的胶原贴敷料中的应用。

12、此外，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含上述重组iii型人源化胶原蛋白、可接受的赋形剂。

13、本发明提供的新的重组iii型人源化胶原蛋白是以人iii型胶原蛋白α1链为基础，沿着三螺旋区域滑动一个10个三联体长的窗口，根据打分函数计算各窗口的稳定性得分；在得分高的序列片段中选取两头都为gpp的序列片段，按顺序拼接，得到目标序列片段，接着以目标序列片段为单元，进行10次串联重复，最后在尾部加上gppgpccggg，得到本发明的重组iii型人源化胶原蛋白。本发明制得的重组iii型人源化胶原蛋白具有稳定性强、表达量高、溶解性好的优点，同时该重组iii型人源化胶原蛋白具有显著的促进细胞增殖和促进细胞黏附作用。

14、总之，与现有技术相比，本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白具有以下优势：

15、(1)本发明采用先进的ai技术和分子动力学模拟，设计了全新的iii型胶原蛋白序列，全面提升了iii型胶原蛋白的结构稳定性和抗降解性，解决了iii型胶原蛋白稳定性差、易降解等问题。

16、(2)本发明提供的新的重组iii型人源化胶原蛋白氨基酸序列可以在酵母表达系统中表达并分泌，且表达量较高，将发酵上清液稀释10倍，电泳条带亮度为66.2kd标准品的4倍，而且该重组iii型人源化胶原蛋白在摇瓶、发酵和纯化过程中，条带单一，稳定性高，没有出现降解条带。

17、(3)本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白有较强的溶解性，在盐溶液中的溶解度可达100g/l。

18、(4)本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白对人胚皮肤成纤维细胞(esf)有显著促进增殖作用，在0.03125mg/ml的重组iii型人源化胶原蛋白的细胞增值率为132.13％，是1mg/ml牛i型胶原标准品的1.24倍。

19、(5)本发明提供的重组iii型人源化胶原蛋白对l929细胞有显著促进黏附作用，在1mg/ml的重组iii型人源化胶原蛋白的细胞黏附率为78.66％，是2mg/ml牛i型胶原标准品的2.69倍。