一种用于NGS测序的血浆RNA提取和建库方法及其应用与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种用于ngs测序的血浆rna提取和建库方法及其应用。

背景技术：

1、rna测序(rna-seq)技术是研究差异基因表达、mrna差异剪接等方向不可或缺的重要技术手段。随着高通量测序技发展，rna-seq技术也在不断的发展。目前的rna-seq可以用于研究rna相关的各方面生物学问题，包括单细胞基因表达翻译、rna结构、空间转录学、全转录组、rna-蛋白互作等。但目前的rna-seq主要受制于目标rna的富集和杂质的去除(如dna或rrna)。

2、目前针对血浆游离rna的建库试剂盒一般使用dnase i去除dna污染，然后基于高温灭活和磁珠纯化去除来实现对于dnase i的灭活或去除。但这些方法都有弊端，如在高温灭活dnase i时，由于dnase i缓冲液的存在，会导致rna出现降解，从而产生样品的损失。而对于磁珠纯化，由于血浆中的游离rna含量极低，磁珠纯化也会带来进一步的rna损失，从而容易造成最终的文库质控不合格。而且，对于正常血浆样本而言，还要注意的是，其线粒体rrna(mt-rrna)占总rna的比例较高，因此有必要在建库过程中去除。目前常用rrna探针法将rrna在反转录过程中去除，但这种方法成本较高，难于实装于大规模长期使用，极大的限制了相关技术的发展。

3、因此，亟需开发一种能够有效克服上述问题的血浆rna提取和建库方法，从而可以有效用于ngs测序，提高相关技术的普适性并推动其规模化发展。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术和其他方面中的问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种用于ngs测序的血浆rna提取和建库方法及其应用。本发明中的方法可以对血浆中提取的微量rna进行建库，得到的文库消除了dna污染和含量较高的核糖体rna，且文库浓度、文库片段分布符合二代测序要求。而且本发明中的方法有效解决了dna去除时的样本损失问题和现有的mt-rrna去除成本问题，从而提高了ngs测序在rna测序中的泛用性和并为规模化测序提供了可能性。

2、本发明的第一个方面，提供了一种rrna去除试剂，所述rrna去除试剂包括sgrna预混液和核酸酶。

3、在本发明的一些实施方式中，所述sgrna预混液包括：

4、(1)具有如seq id no:1-46所示序列中的至少一个所示的至少一个sgrna；或

5、(2)具有与(1)中所述sgrna至少95％序列一致性，且靶位点相同的sgrna变体。

6、在本发明的一些实施方式中，所述sgrna预混液中，每种sgrna的加入量(体积百分比，相对于sgrna预混液总体积)为1-10％。

7、在本发明的一些实施方式中，(1)为具有如seq id no:1-46所示序列中的至少1个所示的至少2个sgrna。

8、在本发明的一些实施方式中，(1)为具有如seq id no:1-46所示序列的sgrna的组合。

9、在本发明的一些实施方式中，(1)为如seq id no:1-46所示序列的sgrna的组合。

10、在本发明的一些实施方式中，(2)为具有与(1)中所述sgrna 95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，且靶位点相同的sgrna变体。

11、在本发明的一些实施方式中，所述sgrna变体相对于原sgrna存在1个碱基被替换、删除或增加。

12、在本发明的一些实施方式中，所述核酸酶包括：cas9、cas12a、cas12b、cas13a和cas14中的至少一个。

13、当然，需要理解的是，本领域技术人员也可以根据实际使用需求调整核酸酶的选择，包括但不限于上述的核酸酶。

14、在本发明的一些实施方式中，所述核酸酶为cas9。

15、在本发明的一些实施方式中，所述rrna包括线粒体rrna(mt-rrna)。

16、在本发明的一些实施方式中，所述sgrna预混液和核酸酶可以是独立包装，也可以是使用本领域常规技术手段包装于同一容器或体系中。

17、在本发明的一些实施方式中，所述rrna去除试剂还包括缓冲液。

18、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为酶切反应缓冲液，包括但不限于cas9nuclease reaction buffer。

19、在本发明的一些实施方式中，所述rrna去除试剂由sgrna预混液、cas9酶和cas9核酸酶反应缓冲液组成。

20、在本发明的一些实施方式中，所述rrna去除试剂的组成如表1所示。

21、在本发明的一些实施方式中，所述rrna包括mt-rrna。

22、本发明的第二个方面，提供了一种文库构建产品，所述文库构建产品中包括上述方面所述的rrna去除试剂，和缓冲液。

23、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为核酸酶缓冲液。

24、在本发明的一些实施方式中，所述核酸酶缓冲液包括但不限于cas9 nucleasereaction buffer。

25、在本发明的一些实施方式中，所述文库构建产品还包括与rna文库构建相关的其他产品。

26、在本发明中，“与rna文库构建相关的其他产品”是指本领域技术人员在rna文库构建全过程中会使用到的一切试剂，包括但不限于：核酸提取试剂、反转录试剂、纯化试剂(如磁珠等)、接头序列等。

27、在本发明的一些实施方式中，所述文库构建产品包括文库构建套装或试剂盒。

28、本发明的第三个方面，提供了上述方面所述的rrna去除试剂或文库构建产品在制备测序产品中的应用。

29、在本发明的一些实施方式中，所述测序产品为第二代测序(ngs)产品。

30、在本发明的一些实施方式中，所述测序产品包括测序平台和测序试剂盒。

31、在本发明的一些实施方式中，所述测序产品用于含有rna的样本的测序。

32、在本发明的一些实施方式中，所述含有rna的样本包括含有rrna的样本。

33、在本发明的一些实施方式中，所述rrna包括mt-rrna。

34、本发明的第四个方面，提供了一种rna文库构建方法，包括：dna去除步骤和rrna去除步骤。

35、在本发明的一些实施方式中，所述dna去除步骤包括：

36、使用脱氧核糖核酸酶(dnase)对rna样本进行处理后加入脱氧核糖核酸酶终止液处理。

37、在本发明的一些实施方式中，所述脱氧核糖核酸酶(dnase)的加入量为0.5-4u，加入脱氧核糖核酸酶(dnase)后的处理时间为10min-16h。

38、在本发明的一些实施方式中，所述rrna去除步骤包括：

39、向待去除rrna的体系中加入上述方面所述的rrna去除试剂或文库构建产品。

40、在本发明的一些实施方式中，所述rna文库中不含或基本上不含dna。

41、在本发明中，术语“基本上”是指所述值的±10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。在本发明中，基本上不含dna包括：相比于现有的方法，文库中的dna含量显著下降。

42、在本发明中，显著性差异可以采用任意本领域中的常规统计学方法分析得到，以p值小于0.5、0.1或0.05作为显著性差异的阈值。

43、在本发明的一些实施方式中，所述rna文库中的rrna含量相比于现有的方法显著下降。

44、在本发明的一些实施方式中，以离体样本为样品时，所述rna文库中的rrna含量相比于现有的方法，下降幅度至少为6.25％。

45、在本发明的一些实施方式中，以标准品或纯物质为样品时，所述rna文库中的rrna含量相比于现有的方法，下降幅度至少为55.5％。

46、在本发明的一些实施方式中，所述dnase包括dnase i和dnase ii。

47、在本发明的一些实施方式中，所述dnase为dnase i。

48、在本发明的一些实施方式中，所述脱氧核糖核酸酶终止液为dnase i终止液。

49、在本发明的一些实施方式中，所述dnase i终止液为edta溶液。

50、在本发明的一些实施方式中，所述edta溶液的浓度为20-500mm。

51、在本发明的一些实施方式中，在dnase酶切时还加入有dnase i缓冲液。

52、在本发明的一些实施方式中，所述待去除rrna的体系已经过末端修复、poly a加尾和接头连接。

53、在本发明的一些实施方式中，所述rna文库构建方法还包括在rrna去除步骤后进行文库扩增。

54、在本发明的一些实施方式中，所述rna文库构建方法还包括在末端修复前，进行打断(片段化)和/或反转录。

55、在本发明的一些实施方式中，所述rna文库构建方法具体包括：提取总rna，去除dna，打断(片段化)，反转录，末端修复，poly a加尾，接头连接，使用上述方面所述的rrna去除试剂或文库构建产品去除rrna和pcr扩增。

56、在本发明的一些实施方式中，所述rna文库构建方法中还包括：纯化、定量和质检。

57、本发明的第五个方面，提供了上述方面所述的rna文库构建方法在离体生物样本检测中的应用。

58、在本发明的一些实施方式中，所述离体生物样本检测用于患病风险预测。

59、在本发明的一些实施方式中，所述离体生物样本检测可以不涉及疾病的诊断。

60、在本发明的一些实施方式中，所述离体生物样本包括全血样品、血浆样本、血清样本、细样本。

61、本发明的第六个方面，提供了一种rrna去除方法，所述方法包括：向待去除rrna的体系中加入上述方面所述的rrna去除试剂或文库构建产品。

62、在本发明的一些实施方式中，所述rrna去除试剂与文库构建产品的混合比例为摩尔比10:1-2000:1；cas9蛋白与与文库构建产品的混合比例为摩尔比10:1-200:1。

63、本发明的有益效果是：

64、1.本发明提供了一种rrna去除试剂，能够在低成本的条件下去除rrna，显著降低了文库中的rrna含量和比例。

65、2.本发明中的方法全面的解决了现有技术中对于使用血浆rna来作为样本进行提取和建库时所面对的问题，通过使用改进的dnase i终止液，在不损失rna的同时，有效去除dna，且不影响文库片段分布，同时还克服了传统方法(探针法)成本较高、无法长期大规模使用的缺陷，有效降低了文库中的rrna含量和比例，提高了文库的有效性，从而提高了ngs测序在rna测序中的泛用性和并为规模化测序提供了可能性。