一种抗猪源IgA单克隆抗体及其在PEDVIgA抗体检测中的应用

本发明属于分子与免疫学诊断，具体涉及一种抗猪源iga单克隆抗体及其在pedv iga抗体检测中的应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(ped)是由猪流行性腹泻病毒(pedv)引起的猪肠道性疾病，可导致猪严重呕吐和急性腹泻。临床症状因年龄而异，仔猪尤其脆弱，死亡率高达100％。pedv是猪肠道病毒的一种，感染后主要刺激粘膜免疫，而iga是动物体内最丰富的免疫球蛋白，在肠粘膜免疫中起着重要作用，有效地阻止了病毒的入侵。研究表明，仔猪主要通过母体分泌的母猪乳汁中的iga(siga)抗体获得对pedv的被动免疫保护。因此，母猪体内iga抗体水平是评价疫苗免疫原性的关键指标。siga是人体粘膜防御系统的重要组成部分，存在于哺乳动物的分泌物中，如初乳、眼泪和唾液，它是必不可少的粘膜屏障。当怀孕母猪接种pedv疫苗时，升高的iga水平激活肠黏膜免疫。这些iga分泌细胞迁移并定位于母猪乳腺附近，将pedv特异性iga释放到初乳和乳汁中，然后被新生仔猪消耗，从而阻止pedv穿透肠上皮。因此，iga抗体对于保护新生仔猪免受pedv感染至关重要。监测初乳和唾液中的iga水平对母猪及新生仔猪的健康至关重要。通过唾液和粘膜拭子检测iga抗体提供了一种更简单、更快速的方法，以替代检测母猪初乳中的iga。

2、pedv是一种包膜单链rna病毒，属α-冠状病毒亚属，属冠状病毒科，属尼多病毒目。其病毒颗粒为球形，大小在95-190纳米之间，在外观和结构上与其他冠状病毒相似，但在电子显微镜下很容易与其他病毒区分。成熟的pedv病毒颗粒由四种主要结构蛋白组成：刺突糖蛋白、核蛋白、糖基化膜蛋白和糖基化包膜蛋白。s蛋白是这些结构蛋白中最大的一个，在病毒入侵过程中与细胞受体相互作用，是主要的免疫原性蛋白，在启动免疫反应和诱导中和抗体中起关键作用，导致强烈的宿主反应。因此，pedv s蛋白已成为病毒检测和疫苗研究的主要靶点。目前市面上用于猪血清iga抗体检测的试剂盒大多采用间接elisa法，将纯化的病毒作为包被抗原。这些试验通常使用母猪初乳作为测试样本来评估疫苗免疫水平。然而，这种方法有局限性，包括测定时间长，需要高度纯化的抗原和酶标记的二抗，这使得试剂盒使用起来步骤繁琐，生产成本高。

3、时间分辨荧光免疫层析(trfia)试纸条是一种结合了免疫吸附技术和时间分辨荧光技术的超灵敏检测方法。它们已广泛应用于食品安全和临床检测等领域，与传统检测方法相比，具有成本低、使用方便、检测快速、灵敏度和特异性更高等优点。荧光纳米微球作为一种新型材料，使荧光免疫层析保留了传统胶体金试纸条在现场检测时的便利性，同时发出更亮的荧光信号，显著提高了灵敏度。这使它们成为现场检测的理想选择。同时，稀土螯合物作为独特的功能微球，可以在每个微球内封装数百个荧光分子，大大提高了荧光标记效率和稳定性。这使它们成为检测过程的优秀发光材料。与传统胶体金标记相比，镧系金属标记显著提高了荧光标记效率和标记持久性。它还提供更低的背景荧光干扰，更高强度的荧光信号和更大的标记稳定性。镧系元素荧光微球的这些特点使trfia更加灵敏和特异，成为一种具有巨大潜力的检测工具。

4、本发明利用trfia技术，结合抗猪源iga单克隆抗体和pedv s蛋白，建立了一种快速、定性的pedv iga抗体检测方法，旨在有效预防pedv，为猪免疫状态的准确监测提供新的途径。与传统的免疫层析方法不同，该方法采用eu(iii)螯合物颗粒作为荧光报告系统，有效解决了传统荧光标记稳定性差、易光漂白、灵敏度低等问题。与传统的纳米金方法相比，它也具有更高的灵敏度和准确性。此外，荧光微球试纸条使用简单，整个检测过程只需要10-15分钟，可以实现现场快速、便捷检测，而不需要复杂的实验室设备或技术。进一步评估了eu(iii)螯合物荧光微球试纸条的性能，评估了其敏感性、特异性、准确性和稳定性，并通过临床样品分析验证了其实用性。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗猪源iga单克隆抗体及其在pedv iga抗体检测中的应用。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种抗猪源iga单克隆抗体，所述抗猪源iga单克隆抗体的重链可变区cdr包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr3；

3、所述抗猪源iga单克隆抗体的体轻链可变区cdr包括氨基酸序列如seq id no.4所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.5所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.6所示的cdr3。

4、优选地，所述抗猪源iga单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述抗猪源iga单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。

5、第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的抗猪源iga单克隆抗体在制备pedviga抗体检测试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

6、第三方面，本发明提供了一种检测pedv iga抗体的trfia试纸条，所述trfia试纸条包括pvc底板和依次搭载在pvc底板上的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光微球标记的抗猪源iga单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有pedv s蛋白，所述质控线上包被有iga抗体。

7、优选地，所述荧光微球为eu3+螯合荧光微球。

8、优选地，所述荧光微球与抗猪源iga单克隆抗体的体积质量比为1:1。

9、优选地，所述质控线上iga抗体的包被浓度为0.2mg/ml。

10、第四方面，本发明提供了上述第三方面所述的trfia试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：

11、(1)制备pedv s重组蛋白，并在硝酸纤维素膜上划线获得检测线；

12、(2)将iga抗体在硝酸纤维素膜上划线获得质控线；

13、(3)制备荧光微球标记的抗猪源iga单克隆抗体，并将荧光微球标记的单克隆抗体包被在结合垫上；

14、(4)将干燥的硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸和样品垫组装在pvc垫板上获得trfia试纸条。

15、优选地，所述荧光微球标记的抗猪源iga单克隆抗体的制备方法为：将荧光微球乳胶加入400μl硼酸缓冲液，加入edc和nhs溶液，在室温下激活混合物15分钟；冷却至10℃，离心取上清液，用硼酸缓冲液重悬颗粒；加入100μl iga抗体，室温振荡，然后加入10％的bsa溶液，在室温下封闭或密封并在4℃下避光保存；10℃，离心10分钟；最后，加入荧光微球标记保护剂，重悬微球，制备获得荧光微球标记抗猪源iga单克隆抗体。

16、具体为：充分摇动容器，将50μl荧光微球转移到2ml离心管中，加入400μl硼酸缓冲液，使其充分结合；加入适量的edc和nhs溶液，在室温下激活混合物15分钟；活化后，将样品冷却至10℃，18800rpm离心10分钟；取上清液，用500μl硼酸缓冲液重悬颗粒；这个过程重复两次；如果观察到沉淀，将样品超声处理1分钟(100w，3s，3s)以确保完全溶解。在离心管中加入100μl抗猪源iga单克隆抗体，室温振荡2小时；然后加入10％的bsa溶液，在室温下继续震荡2小时。将试管密封并在4℃下避光保存过夜。第二天，将试管在10℃，18800rpm下离心10分钟，重复3次。最后，加入100μl荧光微球标记的保护剂，重悬微球，如果观察到沉淀，则对样品进行超声处理。制备好的荧光微球标记抗猪源iga单克隆抗体液保存在4℃。

17、第五方面，本发明提供了上述第三方面所述的trfia试纸条在以非疾病诊断为目的的pedv iga抗体检测中的应用。

18、优选地，所述trfia试纸条的使用方法为：

19、反应：将样品用磷酸盐缓冲盐水按1:2的比例稀释后充分混合，取50μl的混合物加入trfia试纸条的样品垫上，室温反应11-15分钟；

20、结果判定：在365nm紫外光下，如果质控线和检测线均显示红色荧光带，则为阳性，表明样品中存在iga抗体；如果只有质控线显示红色荧光带，而检测线没有，则为阴性，表明样品中不含iga抗体；如果质控线和检测线都没有显示红色荧光带，或者只有检测线显示红色荧光带，则结果无效。

21、本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种抗猪源iga单克隆抗体，所述单克隆抗体对猪源性iga有效，但对猪源免疫球蛋白igg、igm、igd、ige均无效，具有良好的反应性和特异性；其次，对表达该抗体的细胞提取rna，并对其序列进行测定，分析了不同cdr区的特性；同时，本发明将抗猪源iga单克隆抗体标记在镧系eu3+荧光微球上，建立了一种时间分辨免疫荧光试纸条检测方法，用于iga抗体的定性检测；所述检测方法检测范围宽，灵敏度高，快速测量；具有良好的重复性、准确性和稳定性；且与猪源免疫球蛋白igg、igm、igd、ige无交叉反应，特异性高，能精准反应临床pedv免疫动物的iga抗体水平，其符合率高于97.3％，具有较强的临床应用潜力。