一种用于胰腺癌术后MRD检测及动态监测的引物探针组合物、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于基因检测领域，更具体地，本发明涉及一种用于胰腺导管腺癌(pdac)术后mrd检测及动态监测的引物探针组合物、试剂盒及应用。

背景技术：

1、胰腺癌(pdac)是全球最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其中胰腺导管腺癌（pdac）是最常见和最为致命的。手术切除联合辅助全身化疗目前是唯一的长期生存机会，但是大部分的患者在晚期被诊断出来，这使他们无法进行根治性手术，且大多数接受切除术的患者会在局部或远处复发。pdac常见的检测方法是影像学检测包括造影增强计算机断层扫描（ct）、磁共振成像（mri）和超声内窥镜（eus）等和ca19-9检测。但是基于影像的传统胰腺导管腺癌(pdac)检测的挑战包括高成本、侵入性以及灵敏度和特异性欠佳，这些方法使得不足以早期发现pdac及尽早发现复发。因此迫切需要更为精准的生物标志物和检测方法，以更好地指导胰腺导管腺癌(pdac)的诊疗。

2、近年来，液体活检受到高度关注，其中循环肿瘤dna（circulating tumor dna，ctdna）作为有价值的临床生物标志物应用颇多。与肿瘤组织相比，血液中ctdna受肿瘤内异质性的影响较小。此外，ctdna 的半衰期短，可以作为实时肿瘤生物标志物动态反映肿瘤在特定时刻的状态。同时，ctdna 携带与肿瘤相关的基因组信息，例如基因表达水平、突变和甲基化状态等。与传统的活检标志物相比，ctdna是一种理想的生物标志物，尤其适用于治疗效果的实时监测和预后评估。最近发现，ctdna可以作为准确评估实体瘤微小残留病灶（minimal residual disease，mrd）的有效生物标志物。ctdna mrd检测常见方法包括digital pcr、ngs（next-generation sequencing ,ngs）和wgs（whole genomesequencing），这些方法存在过程繁琐、难以标准化且成本较高的问题。而且使用 ctdna 生物标志物早期检测复发比在伴随诊断中使用这些标志物要困难得多。最近新兴的ctdna 甲基化标志物可以提示 mrd 的存在，并且还可以识别复发风险高的患者。

3、近年来，异常dna甲基化被认为是一种有前途的非侵入性癌症检测标志物。越来越多的证据表明，异常dna甲基化主要通过整体低甲基化、多个基因组区域（主要是cpg位点）的局灶性高甲基化和甲基化胞嘧啶的直接诱变来促进肿瘤发生和肿瘤进展。虽然已有部分针对胰腺导管腺癌(pdac)的甲基化生物标志物研究，但是对胰腺导管腺癌(pdac)血浆中甲基化生物标志物的探索仍处于早期阶段，仍然需要更深入的探究。

4、因此仍然需要开发具有可接受的灵敏度和特异性以及成本低的胰腺导管腺癌(pdac)甲基化标志物检测方法，并适合在大人群中快速检测，同时对特定甲基化生物标志物与肿瘤进展之间调控机制的研究会更好的指正设计方向。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提出了一种用于胰腺癌术后mrd检测及动态监测的引物探针组合物、方法和试剂盒，在本发明中，通过检测mir129-2基因启动子区域甲基化，用于pdac术后mrd检测及动态监测，通过检测及临床随访分析证实了mir129-2启动子区域甲基化可以预测pdac的术后复发。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于胰腺癌术后mrd检测及动态监测的引物探针组合物，包括：特异性检测基因mir129-2启动子甲基化区域和内参基因actb的特异性引物；

4、所述特异性检测基因mir129-2启动子甲基化区域的引物序列为：

5、mir129-2-f：ggagtggtgagattgagtc（seq id no:1）；

6、mir129-2-r：atctccgaaccctaaaaccg（seq id no:2）；

7、所述内参基因actb的特异性引物序列为：

8、actb-f：gtaatgttaggagtattttgtggata（seq id no:3）

9、actb-r：ctaacccaaaaaaacccaatccta（seq id no:4）。

10、作为本发明进一步的方案，所述特异性检测基因mir129-2启动子甲基化区域的荧光探针序列为：

11、mir129-2-p：cgatggaacgcgttggggagatt（seq id no:5）；

12、探针的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

13、内参基因actb的特异性探针序列为：

14、actb-p：agaagaagggaggggtgttaggagagg（seq id no:6）；

15、探针的5’端标记有荧光报告基团cy5，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2。

16、本发明所述的引物探针组合物用于扩增基因mir129-2启动子区域的cpg位点富集区域。

17、本发明还提供了一种用于胰腺癌术后mrd检测及动态监测的试剂盒，包括本发明中提到的引物探针组合物。

18、作为本发明进一步的方案，用于胰腺癌术后mrd检测及动态监测的试剂盒，还包括本发明中提到的探针，进一步优选，还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂pcr mix、阳性对照和阴性对照中的至少一种。

19、在本发明中，通过本发明试剂盒可检测基因mir129-2启动器区域甲基化状态，基因mir129-2启动子区域甲基化状态可作为胰腺导管腺癌(pdac)术后mrd检测及动态监测的标志物, 用于胰腺导管腺癌(pdac)术后患者的复发风险评估。本发明采用多重荧光定量pcr检测方法，特异性和灵敏度高、重复性好，操作简单，性能优于临床使用胰腺导管腺癌(pdac)肿瘤标志物ca19-9； 在ca19-9阴性的患者中, mir129-2基因启动子区域甲基化仍然可以有效预测胰腺导管腺癌(pdac)患者术后复发. 本发明能帮助临床医生更加精准评估胰腺导管腺癌(pdac)术后复发风险，提高治疗效果, 避免不必要的治疗, 从而减少医疗成本。

20、本发明还提供了一种用于胰腺癌术后mrd一种用于胰腺癌术后mrd检测及动态监测试剂盒制备中的应用，包括以下步骤：

21、步骤s1：核酸提取：提取外周血浆或组织的dna;

22、步骤s2：核酸转化：将步骤s1的dna进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或阱盐处理并纯化，获得经修饰的待测样本；

23、步骤s3：靶标扩增：利用本发明中的用于胰腺导管腺癌(pdac)术后mrd检测及动态监测的试剂盒，对经修饰的待测样本进行多重荧光定量pcr扩增；

24、步骤s4：结果判读：同时检测fam和cy5信号通道，通过读取达到设定阈值时所需的循环次数ct值作为判断标准。待测样本cy5信号通道ct值小于31，待测样本有效。在有效的前提下，fam信号通道ct值小于45，并且有典型的s型扩增曲线，待测样本判定为阳性，ct值等于45或无值，待测样本可判定为阴性。

25、步骤s5：甲基化比例计算: 比较ct（δδct）法用于确定样本中mir129-2启动子区域的甲基化比例。使用比较ct（δδct）法，测量样本和参考样本中目标和内源性对照的扩增情况。通过内源性对照对测量结果进行标准化。通过比较每个样本中标准化的目标量与参考样本中标准化的目标量来确定每个样本中甲基化比例。参考样本是人hct116 dko甲基化dna(100%甲基化样本)和人hct116 dko非甲基化dna(0%甲基化样本)，（zymo产品编号：d5014）。

26、步骤s6：血浆样本定量计算:将甲基化比例转化为mhge/ml(每毫升血浆甲基化基因组当量).mhge/ml的计算方法为：（（甲基化比例 * ng * 1000）/ 3.3）/ ml. 其中ng: 为血浆样本cfdna提取总量, ml:为血浆体积。

27、在本发明中，通过上述方法，特定的cpg位点富集区域高甲基化状态时可被特异性扩增，低或无甲基化状态时则无法扩增。

28、本发明具有以下有益效果：

29、本发明的引物探针组合物用于扩增基因mir129-2启动子区域的cpg位点富集区域。利用本发明的方法，特定的cpg位点富集区域高甲基化状态时可被特异性扩增，低或无甲基化状态时则无法扩增。本发明的试剂盒包括基因mir129-2甲基化引物和探针，还包括内参基因actb的引物和探针，通过本试剂盒可检测基因mir129-2启动器区域甲基化状态，基因mir129-2启动子区域甲基化状态可作为胰腺导管腺癌(pdac)术后mrd检测及动态监测的标志物, 用于胰腺导管腺癌(pdac)术后患者的复发风险评估。本发明采用多重荧光定量pcr检测方法，特异性和灵敏度高、重复性好，操作简单，性能优于临床使用胰腺导管腺癌(pdac)肿瘤标志物ca19-9， 在ca19-9阴性的患者中, mir129-2基因启动子区域甲基化仍然可以有效预测胰腺导管腺癌(pdac)患者术后复发. 本发明能帮助临床医生更加精准评估胰腺导管腺癌(pdac)术后复发风险，提高治疗效果, 避免不必要的治疗, 从而减少医疗成本。

30、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。