共同表达H9亚型AIVHA基因、IBVS基因和IBDVVP2基因的重组HVT及其应用

本发明涉及一种共同表达h9亚型禽流感病毒ha基因、传染性支气管炎病毒s基因以及传染性法氏囊病毒vp2基因的重组火鸡疱疹病毒及其在制备h9亚型禽流感、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。本发明属于医学或兽医学。

背景技术：

1、h9亚型禽流感病毒（avian influenza virus，aiv）于1966年首次在美国火鸡群中分离获得，目前已呈世界性分布，其在家禽中的广泛流行给全球养禽业和公共卫生安全构成了持续的威胁。自1992年首次在广东省分离到h9亚型aiv以来，该病己在我国流行30余年，成为影响我国肉鸡养殖业发展最为严重的病原之一。aiv属于正粘病毒科，其编码的ha蛋白能够识别特异性受体，介导病毒入侵宿主细胞，具有较强的免疫原性，是该病毒的主要宿主保护性抗原，能够诱导产生中和抗体。h9亚型禽流感目前主要通过灭活疫苗进行防控，然而近年来h9亚型aiv在我国的分离率逐年上升，表明传统灭活疫苗免疫已不能有效防控h9亚型aiv感染，迫切需要研制更加安全、高效的新型疫苗。

2、鸡传染性支气管炎（ib）是由传染性支气管炎病毒（infectious bronchitisvirus，ibv）引起的一种急性、高度接触性传染病，能够引起鸡呼吸系统、泌尿系统和生殖系统感染。该病一年四季均有流行，在冬春季节尤为严重，临床上常与h9亚型aiv、大肠杆菌及支原体混合感染，从而引起高发病率、高死亡率。刺突蛋白（s）是ibv最重要的结构蛋白，可以诱导产生中和抗体，是ibv的主要宿主保护性抗原。s蛋白包含s1和s2两个亚基，均属于糖蛋白，其中s1蛋白对病毒毒力、组织嗜性和血清型起到决定性作用，并能够诱导宿主产生体液免疫及细胞免疫应答。目前ibv在我国的优势基因型为基因i群19亚型（qx型），主要通过传统弱毒活疫苗和灭活疫苗进行防控。

3、鸡传染性法氏囊病（infections bursal disease，ibd）是由传染性法氏囊病毒（infections bursal disease virus，ibdv）引起的一种主要危害雏鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。ibdv基因组由两个双股rna节段组成，a节段编码的vp2蛋白是ibdv主要的宿主保护性抗原。ibdv主要侵害鸡的免疫器官法氏囊，导致感染鸡免疫机能障碍，降低疫苗的免疫效果。1957年，ibd首次爆发于美国特拉华州的甘布罗镇，引起该病的病原后来被称为ibdv经典强毒。 1982年，我国首次报导了ibdv经典强毒在北京地区的流行，随后该类毒株在我国大部分养禽地区广泛流行。至80年代末，美国和欧洲地区相继出现ibdv超强毒株和抗原变异株，进一步增加了该病的防控难度。

4、重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey virus，hvt）是一种疱疹病毒，基因组较大，可供外源基因插入或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重组活载体疫苗的病毒载体。与其它病毒载体相比，hvt作为病毒载体具有许多优势。其对鸡及其它动物均无致病性，使用安全；hvt疫苗的免疫效果不受母源抗体干扰，可以用于孵化场雏鸡早期免疫；接种后病毒在鸡体内长期存在，刺激机体产生较高的抗体水平并维持终身；hvt疫苗不仅生产成本低，而且可以冻干，易于贮存和运输。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供共同表达禽流感病毒（aiv）ha基因、传染性支气管炎病毒（ibv）s基因和鸡传染性法氏囊病毒（ibdv）vp2基因的重组火鸡疱疹病毒（hvt）病毒株及其应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、本发明的一种共同表达h9亚型aiv ha基因、ibv s基因和ibdv vp2基因的重组hvt病毒株，所述的重组火鸡疱疹病毒病毒株是通过将包含鸡β肌动蛋白启动子、aiv ha基因和ibv s基因编码序列ha2as、土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表达盒cagw-ha2as插入hvt基因组的95322-95323位核苷酸之间，同时将包含小鼠巨细胞病毒启动子、ibdv经典强毒株vp2基因编码序列以及sv40多聚腺苷酸序列的表达盒cmv-ibdvc2插入到hvt基因组的112071-112088位核苷酸之间获得的。

4、其中，优选的，所述的aiv为h9亚型毒株，所述的ibv为qx型毒株，所述的ibdv为经典强毒株，所述的hvt为fc126株，其genbank登录号为af291866。

5、其中，优选的，所述的aiv ha基因是将h9亚型aiv ha基因编码区经鸡密码子优化后获得的，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、其中，优选的，所述的s基因是将qx型ibv s蛋白序列中的s1-s2裂解位点由rrrr突变为gsas，将其第695、768、775、817、862和863位氨基酸突变为脯氨酸，同时将其c端第1097-1165位氨基酸替换为t4纤维蛋白三聚体结构域，并经鸡密码子优化设计后获得的，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、其中，优选的，所述的aiv ha基因和ibv s基因编码序列ha2as是将aiv ha基因编码序列和ibv s基因编码序列用猪捷申病毒2a（p2a）自剪切肽编码序列连接获得的，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

8、其中，优选的，所述的包含鸡β肌动蛋白启动子、aiv ha基因和ibv s基因编码序列ha2as、土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表达盒cagw-ha2as的核苷酸序列如seq id no.4所示。

9、其中，优选的，所述的ibdv经典强毒株vp2基因编码序列如seq id no.5所示。

10、进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组火鸡疱疹病毒病毒株的方法，包括以下步骤：

11、（1）hvt fc126株多片段黏粒拯救系统的建立

12、提取hvt fc126株基因组dna，将fc126株基因组dna分段克隆至pcc1fos载体，选取6个克隆有fc126株基因组dna片段并可拼接覆盖完整hvt基因组的重组黏粒h434、h481、h159、h483、h361、h220，其中，h434包含fc126基因组1- 40394位的核苷酸片段、h481包含fc126基因组31586-69191位的核苷酸片段、h159包含fc126基因组58293-92645位的核苷酸片段、h483包含fc126基因组76940-110712位的核苷酸片段、h361包含fc126基因组103006-134393位的核苷酸片段、h220包含fc126基因组123621-159160位的核苷酸片段；

13、（2）表达aiv ha基因和ibv s基因的重组黏粒的构建及鉴定

14、合成目的基因aiv ha，并在其c端添加猪捷申病毒2a（p2a）自剪切肽序列，合成目的基因ibv s，经融合pcr扩增获得包含ha和s编码序列的目的基因ha2as，其中ha基因和s基因编码区之间以自剪切肽p2a序列连接；将目的基因ha2as克隆入鸡β肌动蛋白启动子下游，同时将土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列插入目的基因ha2as与兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之间，获得共同表达aiv ha基因和ibv s基因的重组质粒pcagw-ha2as；利用red/et重组方法将ha2as基因表达盒克隆入重组黏粒h483中对应于fc126基因组的95322-95323位核苷酸之间，构建获得共同表达ha基因和s基因的重组黏粒h483-53-ha2as；

15、（3）表达ibdv vp2基因的重组黏粒构建及鉴定

16、合成ibdv经典强毒株vp2基因编码序列ibdvc2，将其插入pcmv载体小鼠巨细胞病毒启动子下游，构建获得表达ibdv vp2基因的重组质粒pcmv-ibdvc2；利用red/et重组方法将包含小鼠巨细胞病毒启动子、ibdv vp2基因编码序列以及sv40多聚腺苷酸序列的ibdvc2基因表达盒克隆入重组黏粒h361中fc126基因组的112071-112088位核苷酸之间，构建获得表达ibdv vp2基因的重组黏粒h361-65-ibdvc2；

17、（4）共同表达ha、s和vp2基因的重组hvt的拯救及鉴定

18、利用质粒提取试剂盒提取重组黏粒h483-53-ha2as、h361-65-ibdvc2以及克隆有hvt fc126株基因组片段的其他4个亲本黏粒h434、h481、h159和h220，利用磷酸钙转染法，将上述6个重组黏粒与亲本黏粒共转染cef细胞，培养4-5天出现蚀斑病变后收获病毒，拯救获得在hvt基因组95322-95323位核苷酸之间插入目的基因ha2as表达盒，以及在112071-112088位核苷酸之间插入ibdv vp2基因表达盒的重组病毒h30201。

19、再进一步的，本发明还提出了所述的重组火鸡疱疹病毒病毒株在制备同时预防h9亚型禽流感、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。

20、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

21、本发明利用重组克隆技术，将包含h9亚型aiv ha基因和qx型ibv s基因的表达框架插入到hvt fc126株的95322-95323位核苷酸之间，同时将包含ibdv经典强毒株vp2基因的表达框架插入到hvt基因组的112071-112088位核苷酸之间，拯救获得共同表达h9亚型aiv ha基因、ibv s基因以及ibdv vp2基因的重组hvt疫苗株h30201。实验证明，重组病毒h30201在cef上具有良好的复制能力，且具有良好的遗传稳定性；将重组病毒h30201接种spf鸡后能够提供对h9亚型aiv、qx型ibv强毒和ibdv超强毒的免疫保护。本发明的提出为同时预防h9亚型禽流感、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病提供了有效的技术手段。