本发明涉及一种基于棒状杆菌内源重组酶的谷氨酸棒杆菌基因编辑工具及其应用，属于基因编辑。
背景技术：
1、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是一种广泛用于工业生产的菌株，已被应用于氨基酸、有机酸和萜类化合物等高价值产品的生物合成中。由于其具备生长快速、代谢产物种类丰富和产量高等优点，谷氨酸棒杆菌已逐渐成为工业生物合成领域的理想宿主。因此，开发精准高效的基因编辑工具已成为当前的研究重点，旨在进一步提高其代谢产物合成的效率和多样性。
2、目前，针对谷氨酸棒杆菌的基因编辑工具已取得显著进展，主要使用以下两种策略：一是基于crispr-cpf1系统的基因编辑方法，二是通过使用sacb基因致死筛选实现基因编辑。crispr-cpf1因其高效的dna切割功能被广泛应用于多种微生物的基因组编辑，而sacb基因则常用于实现负筛选，以便有效去除未正确编辑的细胞。尽管这些方法提高了编辑的准确性和可控性，但其编辑效率依然有限。为了进一步提高编辑效率，近年来采用同源重组酶逐渐成为一种有效策略。在原核基因编辑中，rece/rect重组酶系统以及λred系统被广泛应用于多种原核微生物，展现出较高的同源重组效率。
3、在各种微生物基因编辑工具的开发中，当前的研究主要集中于模式菌株，研究人员通常使用同源重组酶，以增强同源重组效率。然而，现有的重组酶系统如rece/rect和λred重组系统，存在兼容性方面的局限性。尤其是在谷氨酸棒杆菌等非模式菌株的应用中，这些重组酶的兼容性较差，难以满足不同微生物底盘的需求，导致基因编辑效率较低。此外，许多开发的基因编辑工具并未针对非模式菌株进行优化，从而限制了它们在非模式菌株中的有效应用。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明通过将筛选得到的一种与非模式菌株谷氨酸棒杆菌s9114兼容性更好的内源重组酶caur与其他常用的基因编辑核酸酶进行组合，为谷氨酸棒杆菌的基因编辑提供了一种新的工具。该工具能够实现高效的基因编辑，并且具有操作简便和时间成本低的优势，为其他非模式菌株的基因编辑提供了重要的参考。
2、本发明的第一个目的是提供一种用于谷氨酸棒杆菌基因编辑的酶组合物，所述酶组合物中包括第一工具酶和第二工具酶，所述第一工具酶的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二工具酶为重组酶和/或核酸酶。
3、进一步地，所述重组酶包括但不限于rece重组酶、rect重组酶、λred重组酶等；所述核酸酶包括crispr核酸酶。
4、优选地，所述crispr核酸酶包括但不限于cpf1、cas9和两者突变体的任一或其组合。
5、本发明的第二个目的是提供编码上述酶组合物的核酸分子。
6、本发明的第三个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒，所述谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒中含有编码第一工具酶和第二工具酶的序列，所述第一工具酶的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二工具酶为重组酶和/或核酸酶。当然，本领域技术人员可以理解，基因编辑质粒中可以含有一个或多个表达载体，如仅有一个表达载体，编码第一工具酶和第二工具酶的序列均位于该载体上；如有多个载体，编码第一工具酶和第二工具酶的序列可分别位于不同载体上。优选地，编码所述第一工具酶和第二工具酶的序列位于同一表达载体(如质粒)上。
7、进一步地，所述谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒中还含有启动所述第一工具酶和/或第二工具酶的启动子。优选地，所述启动子为组成型启动子或诱导型启动子，所述组成型启动子包括hom启动子，所述诱导型启动子包括trc启动子。
8、进一步地，表达载体可选择质粒pjys3、pxmj19质粒等。最优选地，使用质粒pjys3，使用诱导性启动子trc诱导性表达cpf1基因，使用组成型启动子hom表达来自corynebacterium aurimucosumatcc 700975的内源同源重组酶caur。
9、本发明的第四个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌基因编辑系统，所述谷氨酸棒杆菌基因编辑系统中含有所述酶组合物、核酸分子或谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒。
10、进一步地，所述谷氨酸棒杆菌基因编辑系统中还含有配合第一工具酶和第二工具酶发挥基因编辑作用的原件，如crrna、sgrna等。与上相同，本领域技术人员可以理解，这些原件可以与工具酶位于同一载体上或不同载体上，也可不需载体。
11、进一步地，所述谷氨酸棒杆菌基因编辑系统中还含有供体载体，所述供体载体包括目的基因和连接在所述目的基因两端的同源臂。
12、进一步地，所述目的基因包括dsdna、ssdna。所述dsdna模板和ssdna模板根据所要编辑的目标基因进行设计。具体地，使用dsdna实现基因的敲除，使用ssdna实现单碱基突变。
13、进一步地，同源臂长度为60-5000bp。其中，dsdna同源臂长度为100-5000bp；ssdna同源臂长度为60-100bp。优选地，dsdna同源臂长度为1000-2000bp。
14、本发明的第五个目的是提供一种含有所述酶组合物、核酸分子、基因编辑质粒或基因编辑系统的重组谷氨酸棒杆菌。
15、进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌的宿主菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌s9114。
16、本发明中：
17、为了解决非模式菌株基因编辑困难的问题，本发明以c.glutamicum s9114这一非模式菌株为待编辑细胞，通过筛选选出来自corynebacterium aurimucosum atcc 700975的同源重组酶caur对其进行基因编辑，显著提高了c.glutamicum s9114的同源重组能力。并将棒状杆菌内源重组酶caur与cpf1编辑系统相结合，构建了一种针对c.glutamicums9114的高效基因编辑工具。与传统的基于cpf1的基因编辑工具相比，本发明不仅提高了基因编辑的效率，还克服了当前重组酶系统在非模式菌株中的兼容性不足的问题，同时操作简便，时间成本低，也为非模式微生物的基因组工程改造提供了更适用且高效的解决方案。
18、本发明的第六个目的是提供所述酶组合物、核酸分子、基因编辑质粒或基因编辑系统在谷氨酸棒杆菌基因编辑中的应用。
19、进一步地，所述基因编辑包括但不限于基因敲除、碱基突变等。
20、进一步地，当工具酶的启动子为诱导启动子时，所述应用包括添加诱导剂的步骤。优选地，所述诱导剂的浓度为0.2-2.0mm。
21、进一步地，所述应用包括将转化成功的重组谷氨酸棒杆菌进行复苏后，补充诱导剂再次复苏培养的步骤。优选地，补充诱导剂再次复苏培养的时长为0-3小时，诱导剂浓度为0.2-2.0mm。
22、本发明的第七个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌的高效基因编辑方法，包括将所述基因编辑系统编码基因导入谷氨酸棒杆菌中的步骤。
23、本发明的有益效果：
24、本发明通过迭代blast搜索的方法，从棒状杆菌中检索到一系列rect类似的重组酶，并且有四个重组酶在其基因组上游发现具有rece结构。随后测试了这四种重组酶的重组效率，结果显示相较于现有的高效重组酶recet以及red系统，来自corynebacteriumaurimucosumatcc 700975的重组酶caur具有最好的重组效率，并且使用该重组酶进行基因编辑，能够实现基因敲除以及单碱基突变。基于此，本发明以c.glutamicum s9114这一非模式菌株为例，构建了以内源重组酶为基础的结合cpf1的基因编辑工具，以c.glutamicums9114的ldha基因敲除为实例，显著提升了基因编辑效率，使用原始cpf1编辑工具的基因效率为2％，使用我们开发的基因编辑工具效率提升至77％。此外，相较于现有的基因编辑方法，本发明在提高编辑效率的同时，降低了操作复杂度，由于基因编辑系统为单质粒系统，因此仅需电转一次，避免了双质粒系统电转两次的长时间编辑周期的问题，为非模式微生物基因工程的快速开发和应用带来了显著的优势。