塞内卡病毒A猪源Fab抗体及其竞争ELISA检测方法

本发明属于生物，涉及塞内卡病毒a猪源fab抗体及其竞争elisa检测方法。

背景技术：

1、塞内卡病毒ａ（senecavirus a，sva）是小rna病毒科（picornaviridae）塞内卡病毒属（senecavirus）的唯一成员，是引起猪出现水泡性病变的病原。sva是一种无囊膜的单股正链rna病毒，其基因组全长约7.3 kb，依次由5′-非翻译区(untranslated region，utr)（0.66 kb）、开放阅读框(open reading frame ,orf)（6.54 kb）和3′-utr（0.07kb）组成。sva的orf编码一个大的多聚蛋白前体，然后经蛋白酶剪切后形成4种结构蛋白（vp4，vp2，vp3和vp1）和8种非结构蛋白（l，2a，2b，2c，3a，3b，3c和3d）。sva感染导致的临床症状包括在猪鼻镜、口腔上皮及蹄冠处出现水疱、溃烂从而导致跛行，在小日龄仔猪中会引起嗜睡、腹泻、神经系统症状和急性死亡，0～3日龄的仔猪死亡率高达40%～80%，4～7日龄的仔猪死亡率达0～30%。sva感染引起的临床症状与口蹄疫、猪水泡病、水疱性口炎引起的病变相似，在临床上难以区分。自2014年10月以来多个国家均暴发了sva疫情，且流行范围不断扩大，给养猪业造成了重大的经济损失。因此，建立快速、特异的诊断方法对预防和控制sva感染是必要的。

2、目前， sva诊断方法主要有逆转录-pcr（rt-pcr）、病毒中和试验（vnt）、间接荧光抗体试验（ifa）、酶联免疫吸附试验（elisa）等。相比之下，elisa方法简单、快速且易于操作。然而，这些elisa方法所使用的抗体多为鼠源单克隆抗体或兔多克隆抗体。兔多克隆抗体和鼠源单克隆抗体的制备不仅费时费力，需要扑杀动物，而且制备的多克隆抗体和单克隆抗体属于兔源或鼠源抗体，其识别的表位与本动物抗体识别的抗原表位可能存在差异，致使基于这种抗体所建方法的特异性和敏感性亟待提高。近年来，基于单细胞技术与流式分选技术相结合的单克隆抗体制备技术（即单个b细胞抗体技术）进一步优化了抗体制备技术领域的发展，使人们获得针对某抗原的本动物源性单克隆抗体成为可能。该技术核心是从免疫或感染动物中（组织或外周血）分离抗原特异性的 b 细胞，然后通过单细胞 pcr 技术从单个抗体分泌b 细胞中扩增抗体重链和轻链，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术获得的抗体具有抗体的重链和轻链天然配对的特性，这对于抗体的特异性和亲和力至关重要，且该方法具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点。该技术已经应用于寻找人类一些重要传染病的中和抗体，如艾滋病、流感等。

3、fab抗体是免疫球蛋白igg的抗原结合片段，其由完整的轻链（可变区vl和恒定区cl）和部分重链结构（可变区vh和一个恒定区片段ch1）组成，轻链与重链通过一个二硫键连接，其长度相当于全长抗体的1/3，无fc段，体积较小，不易形成空间位阻效应。因此，相较于全长igg来说，fab抗体具有组织穿透性强、更易到达病灶、免疫原性低等优点，且没有fc片段，不会产生抗体依赖性介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性等。在利用单个b 细胞抗体技术获得本动物源抗体的基础上，以fab抗体建立sva的elisa抗体检测方法未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种塞内卡病毒a猪源fab抗体及其竞争elisa检测方法。

2、本发明塞内卡病毒a猪源fab抗体，猪源fab抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如下：

3、重链可变区（seq id no .4）：

4、eeklvesggglvqpggslrlscvgsgftfrstsinwvrqapgkglewlayigssglgtgyadsvkgrftisrdnsqntaylqinslrtedtaryycargcgnsaacaldlwgpgvevvv

5、轻链可变区（seq id no .7）：

6、aiqltqspaslaaslgdtvsitcrasqsvssnldwyqqqpgkapklliysvstlqsgvpfrfkgsgsgtdftltisglqaedvatyychqhnstpygfgagtklelkradakpsvfifppskeqlatptvsvvclinnffpreisvkwkvdgvvqssghpdsvteqdskdsty

7、编码重链可变区基因的核苷酸序列如seq id no.2，编码轻链可变区基因的核苷酸序列如seq id no.8。

8、所述抗塞内卡病毒猪源fab基因工程抗体重链的氨基酸序列如seq id no .3所示；所述抗塞内卡病毒猪源fab基因工程抗体轻链的氨基酸序列seq id no .6所示。

9、本发明还提供了塞内卡病毒a猪源fab抗体在制备检测塞内卡病毒的试剂或试剂盒中的应用。

10、本发明还提供了基于塞内卡病毒a猪源fab抗体的竞争elisa检测方法，包括以下步骤：

11、（1）包被：将塞内卡病毒ａ抗原用pbs稀释至1 μg/ml，取100 μl/孔加入酶标板，4℃静置过夜，pbst洗板3次，拍干；

12、（2）封闭：配置含1% bsa与5%蔗糖的pbst溶液，100 μl/孔，37℃封闭 1 h；

13、（3）检测：分别取1:10稀释的待检血清、标准阴性血清、标准阳性血清与稀释至0.5μg/ml的猪源fab抗体混匀后转移至酶标板，100 μl/孔，37℃孵育1 h，pbst洗板3次，拍干；加入酶标亲和素，100 μl/孔，37℃孵育30 min ，pbst洗板3次，拍干；酶标亲和素为链霉亲和素-hrp，链霉亲和素-hrp的稀释比为1:30000；

14、（4）显色：tmb显色，100 μl/孔，37℃避光孵育15 min；终止并读取450 nm处的吸光值；

15、（5）判定结果：计算抑制百分率pi，以47％的pi为临界值，当待测血清pi<47%，检测结果为阴性，当待测血清pi≥47%，检测结果为阴性。

16、本发明构建了轻链和重链天然配对的猪源fab抗体，并利用该抗体建立了sva竞争elisa检测方法，并对其敏感性、特异性、重复性、与病毒中和试验(vnt)符合率进行测定。结果表明：成功制备了1株sva中和性的fab基因工程抗体，命名为1m33fab株，与sva之间有较高的亲和力；确定c-elisa方法的sva粒子最佳包被浓度为1 μg/ml、竞争抗体bio-1m33fab最适工作浓度为0.5 μg/ml、待检血清样本最佳稀释比例为1:10、酶标亲和素最佳稀释比为1:30 000；确定抑制百分率pi为47%时，敏感性和特异性最高，分别为96.88%和100%，且与常见的主要猪病毒病阳性血清不发生反应；批内变异系数范围为1.12%~7.34%、批间变异系数范围为1.19%~11.72%，表明重复性较好；利用该方法和vnt检测同时检测了224份临床猪血清样本，符合率为93.75%。