产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用及虾青素的制备方法与流程

本发明属于虾青素微生物合成的，尤其涉及一种产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用及虾青素的制备方法。

背景技术：

1、虾青素的化学名为3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素，为一种酮式类胡萝卜素，其与其他类胡萝卜素相比具有非常优秀的抗氧化作用，被广泛应用于日化用品、医药行业、食品保健业以及水产畜牧业等领域中。

2、目前，虾青素的生产方式主要有天然提取法、化学合成法和微生物合成法。天然提取法指的是从虾、蟹等甲壳类废弃物中提取虾青素的方法，但是存在着产量极低、成本高以及所得虾青素纯度低等问题。化学合成法的工艺流程复杂，且合成得到的虾青素存在着生物活性低、稳定性差以及纯度低等问题。微生物合成法指的是利用雨生红球藻等本身具有虾青素合成能力的菌株，或者是通过基因工程技术在大肠杆菌、酿酒酵母以及解脂耶式酵母等常见工程菌中引入外源的虾青素酶合成代谢通路获得具有虾青素合成能力的重组菌株，合成得到虾青素。微生物合成法所得虾青素构型明确，且具有环境友好、副产物少等优点，是一种极具潜力的虾青素生产方式。但是，所引入的外源的虾青素酶合成代谢通路与工程菌天然代谢之间的冲突极大限制了虾青素的合成效率；并且，虾青素及类胡萝卜素等中间产物会被储存于膜性细胞器和细胞膜中，往往给工程菌造成负担，造成生长抑制，严重者甚至导致细胞死亡，存在着虾青素合成效率低以及工程菌株对于虾青素积累的承受能力差等问题，具有一定的局限性。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是为了解决现有虾青素微生物合成法中存在的虾青素合成效率低以及工程菌株对于虾青素积累的承受能力差等原因所带来的虾青素产量低的问题，而提供一种具有高产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株，该解脂耶氏酵母工程菌株具有优秀的虾青素产量。

2、本发明的第二目的在于提供上述产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法。

3、本发明的第三目的在于提供上述产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株在虾青素制备领域的应用。

4、本发明的第四目的在于提供一种虾青素的制备方法。

5、具体的，本发明提供的产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株的底盘细胞为产萜烯类化合物的解脂耶氏酵母，所述解脂耶氏酵母工程菌株过表达过氧化物酶体膜蛋白pex11和过氧化物酶体靶向信号i型受体pex5，且所述解脂耶氏酵母工程菌株能够同时合成表达β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮化酶。

6、进一步地，所述过氧化物酶体膜蛋白pex11包括序列如seq id no:24所示的氨基酸片段。

7、进一步地，所述过氧化物酶体靶向信号i型受体pex5包括序列如seq id no:25所示的氨基酸片段。

8、进一步地，所述β-胡萝卜素羟化酶包括序列如seq id no:49所示的氨基酸片段。

9、进一步地，所述β-胡萝卜素酮化酶包括序列如seq id no:50所示的氨基酸片段。

10、进一步地，所述产萜烯类化合物的解脂耶氏酵母表达萜烯合酶。

11、进一步地，所述萜烯合酶包括八番茄红素脱氢酶carb、番茄红素环化酶和八氢番茄红素合成酶双功能酶carpr、ɑ-法尼烯合酶ɑfs、多功能胡萝卜素合酶cars、柠檬烯合酶中的一种或多种。

12、进一步地，所述八番茄红素脱氢酶carb包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段。

13、进一步地，所述番茄红素环化酶和八氢番茄红素合成酶双功能酶carpr包括序列如seq id no:2所示的氨基酸片段。

14、进一步地，所述ɑ-法尼烯合酶ɑfs包括序列如seq id no:3所示的氨基酸片段。

15、进一步地，所述多功能胡萝卜素合酶cars包括序列如seq id no:4所示的氨基酸片段。

16、本发明提供的产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法包括：基于pex11基因和pex5基因，构建得到pex11-pex5表达框，取pex11-pex5表达框与质粒载体i进行重组，得到重组质粒pex11-pex5；基于crtz基因和crtw基因，构建得到crtz表达框和crtw表达框，取crtz表达框和crtw表达框与质粒载体ii进行重组，得到重组质粒crtz-crtw；取重组质粒pex11-pex5和重组质粒crtz-crtw依次转化产萜烯类化合物的解脂耶氏酵母，得到所述解脂耶氏酵母工程菌株。

17、进一步地，所述pex11基因包括序列如seq id no:9所示的核苷酸序列。

18、进一步地，所述pex5基因包括序列如seq id no:16所示的核苷酸序列。

19、进一步地，所述pex11-pex5表达框包括沿着5’至3’方向依次连接的tef启动子、pex11基因、xpr2终止子、tef启动子、pex5基因和xpr2终止子。

20、进一步地，所述重组质粒pex11-pex5包括至少两组pex11-pex5表达框。

21、进一步地，所述crtz基因包括序列如seq id no:33所示的核苷酸序列。

22、进一步地，所述crtw基因包括序列如seq id no:40所示的核苷酸序列。

23、进一步地，所述crtz表达框包括沿着5’至3’方向依次连接的tef启动子、crtz基因和xpr2终止子。

24、进一步地，所述crtw表达框包括沿着5’至3’方向依次连接的tef启动子、crtw基因和xpr2终止子。

25、进一步地，所述重组质粒crtz-crtw包括沿着5’至3’方向依次连接leu-promoter-leu2序列、crtz表达框和crtw表达框。

26、进一步地，所述解脂耶氏酵母工程菌株还导入有辅助质粒，所述辅助质粒包括grna序列。

27、进一步地，所述grna序列包括如seq id no:46所示的核苷酸片段。

28、本发明还提供了上述产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株在虾青素制备领域的应用。

29、本发明提供的虾青素的制备方法包括：取上述产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株进行发酵培养，得到所述虾青素。

30、有益效果：

31、本发明提供的解脂耶氏酵母工程菌株中，通过过氧化物酶体膜蛋白pex11和过氧化物酶体靶向信号ⅰ型受体pex5的过表达，有利于胞内过氧化物酶体丰度的提高以及蛋白质过氧化酶体的转入，提高过氧化酶体的运作效率，以促进胞内萜烯类化合物的合成及β氧化过程为虾青素的合成提供前体物质，有利于实现虾青素的大量合成；同时，过表达的过氧化物酶体膜蛋白pex11和过氧化物酶体靶向信号ⅰ型受体pex5协同作用，促进增强过氧化酶体作为脂类物质代谢小体的相关性能，有效地转化虾青素生物合成过程中所产生的脂质中间物，不仅有利于虾青素的合成，同时还可有效地提高细胞对虾青素的容量，使得所述解脂耶氏酵母工程菌株不论是在小规模或大规模发酵培养中均表现出了优秀的虾青素合成能力，该解脂耶氏酵母工程菌株在50ml摇瓶发酵水平，虾青素产量可达35mg/l，在5l发酵罐发酵水平，虾青素产量可达145mg/l，虾青素产量有了显著提升，这为虾青素的大规模工业生产提供了基础，具有良好的应用前景。