产生人源化抗体的动物模型及其构建方法与流程

本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种产生抗体的非人动物模型及其构建方法。

背景技术：

1、治疗性单克隆抗体药物经历了三十多年的发展，已经成为生物医药的最重要组成部分之一，是目前快速增长且最先进、有效的一类药物。自1986年okt3首次获得批准以来，治疗性抗体的发展历程见证了快速且变革性的进步，巩固了其作为现代生物制药重要方面的地位。尽管取得了这些成功，但挑战仍然存在，包括基于抗体的药物开发的成功率低、成本高和时间长。近来，免疫原性导致的抗药物抗体(ada)的问题也引起了人们的严重关注，特别是对于被归类为大分子药物的治疗性抗体。克服临床前阶段ada形成风险仍然是一项复杂的任务。

2、目前，较常用于治疗性单克隆抗体发现及筛选的方法是“展示技术”，包括噬菌体展示、细菌展示和酵母展示等。“展示技术”可快速筛选抗体，但是，因缺乏体内的抗体可变区重组和亲和力超突变过程，这些方法筛选出的抗体多样性及亲和能力有限，往往需要花费大量的成本及周期进行进一步优化改造。另一种较常用于治疗性单克隆抗体发现及筛选的方法是直接使用野生型动物模型进行免疫发现，如禽类、啮齿类动物、非人灵长类等。对上述方法获得的分子进行基于经验和计算机数据库预测的人源化改造，是常用避免免疫原性带来的ada效应采取的方法，但其最终改造结果常常不可预计且与临床实际效果脱离，导致临床治疗时的过敏应激等副作用和抗抗体的中和失去疗效。

3、规避以上问题而发现完全人抗体的一种可能的方法是使用经工程化携带人抗体基因的非人动物。目前众多可用的非人动物虽然能够产生完全人抗体，但由于人类抗体编码谱系的庞大性及复杂性，这些模型多具有一些主要的缺点或限制。如它们往往仅包含极少或部分的人抗体谱系，而大部分人类抗体谱系的缺乏则意味着最终发现的抗体分子的多样性匮乏以及获得高亲和的可能性下降。并且随之而来的是较低的v(d)j重组效率，抗体产量低于正常水平。另外还掺杂有动物本身的内源抗体编码渗入带来的免疫原性问题、动物本身内源基因大片段缺失导致的基因缺陷表型问题等等。诸如这些问题以前一些其他问题的存在，使得业界需要一种包含全部人免疫球蛋白可变区编码基因的非人动物，且具有不改变免疫响应以产生人源化抗体的能力。以此有效且高效的生产适用于临床的可变区全人化抗体。

技术实现思路

1、本技术提供了一种非人动物和制备非人动物的方法，所述非人动物的基因组包含在免疫球蛋白基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白可变区基因。本技术的非人动物可以避免干扰动物本身基因表达及调控、避免内源性可变区基因的泄露，并且和抗体产生上具有巨大优势。

2、一方面，本技术提供了一种制备非人动物的方法，所述方法包括在所述非人动物的免疫球蛋白基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白可变区基因。

3、在某些实施方式中，所述方法包括在所述非人动物的重链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白重链可变区基因。在某些实施方式中，所述方法包括在所述非人动物的重链恒定区基因座下游可操作地连接一个或多个人重链v、d或j区或其片段的基因。在某些实施方式中，所述多个人重链v、d或j区或其片段的基因可以进行重组。在某些实施方式中，所述多个人重链v、d或j区或其片段的基因直接连接。

4、在某些实施方式中，所述方法包括在所述非人动物的轻链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白轻链可变区基因。在某些实施方式中，所述方法包括在所述非人动物的轻链恒定区基因座下游可操作地连接一个或多个人轻链v或j区或其片段的基因。在某些实施方式中，所述多个人轻链v或j区或其片段的基因可以进行重组。在某些实施方式中，所述多个人轻链v或j区或其片段的基因直接连接。

5、因此，另一方面，本技术提供了一种制备非人动物的方法，所述方法包括在所述非人动物的免疫球蛋白重链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白重链可变区基因。

6、另一方面，本技术提供了一种制备非人动物的方法，所述方法包括在所述非人动物的免疫球蛋白轻链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白轻链可变区基因。

7、一方面，本技术提供了一种非人动物或非人动物细胞，其基因组包含在免疫球蛋白基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白可变区基因。下述提到的在非人动物中包含的特征均包含在非人动物细胞中。

8、在某些实施方式中，所述非人动物的重链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白重链可变区基因。在某些实施方式中，所述非人动物的重链恒定区基因座下游可操作地连接一个或多个人重链v、d或j区或其片段的基因。在某些实施方式中，所述多个人重链v、d或j区或其片段的基因可以进行重组。在某些实施方式中，所述多个人重链v、d或j区或其片段的基因直接连接。

9、在某些实施方式中，所述非人动物的轻链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白轻链可变区基因。在某些实施方式中，所述非人动物的轻链恒定区基因座下游可操作地连接一个或多个人轻链v或j区或其片段的基因。在某些实施方式中，所述多个人轻链v或j区或其片段的基因可以进行重组。在某些实施方式中，所述多个人轻链v或j区或其片段的基因直接连接。

10、因此，另一方面，本技术提供了一种非人动物或非人动物细胞，所述非人动物或非人动物细胞的免疫球蛋白重链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白重链可变区基因。

11、另一方面，本技术还提供了所述非人动物的后代。该后代可以是非人动物与相同基因型或其它基因型交配产生的后代。

12、另一方面，本技术还提供源自所述非人动物或其后代的细胞(例如，干细胞、胚胎干细胞、免疫细胞、b细胞、t细胞或杂交瘤)或细胞系或其原代细胞培养物。

13、另一方面，本技术提供了一种非人动物或非人动物细胞，所述非人动物或非人动物细胞的免疫球蛋白轻链基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白轻链可变区基因。

14、在某些实施方式中，所述非人动物包含内源性免疫球蛋白可变区基因。在某些实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白可变区基因的完整性未受破坏。在某些实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白可变区基因的表达调控元件的功能未受破坏。在某些实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白可变区基因包含功能性蛋白编码基因和功能性microrna基因。在某些实施方式中，所述非人动物包含完整的内源性免疫球蛋白可变区的表达调控元件。在某些实施方式中，所述非人动物包含完整的内源性免疫球蛋白可变区基因。

15、在某些实施方式中，所述非人动物不表达内源性免疫球蛋白可变区。在某些实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白可变区基因不表达功能蛋白。

16、在某些实施方式中，所述非人动物的人免疫球蛋白可变区基因与内源性免疫球蛋白可变区基因的转录方向相反。

17、在某些实施方式中，所述非人动物的免疫球蛋白恒定区基因与内源性免疫球蛋白可变区基因的转录方向相反。所述非人动物的免疫球蛋白恒定区基因可以是内源性的。所述非人动物可以不包含外源性免疫球蛋白恒定区基因。

18、在某些实施方式中，所述非人动物中人免疫球蛋白可变区基因与非人动物的免疫球蛋白恒定区基因的转录方向相同。

19、在某些实施方式中，所述非人动物中的人免疫球蛋白重链可变区基因与内源性免疫球蛋白重链可变区基因之间包含重链恒定区基因。在某些实施方式中，所述非人动物中的人免疫球蛋白重链可变区基因与内源性免疫球蛋白重链可变区基因之间包含一个或多个重链恒定区基因。在某些实施方式中，所述非人动物中的人免疫球蛋白重链可变区基因与内源性免疫球蛋白重链可变区基因之间的距离为169kbp-240kbp。

20、在某些实施方式中，所述非人动物中的人免疫球蛋白轻链可变区基因与内源性免疫球蛋白轻链可变区基因之间包含轻链恒定区基因。在某些实施方式中，所述非人动物中的人免疫球蛋白轻链可变区基因与内源性免疫球蛋白轻链可变区基因之间包含一个或多个轻链恒定区基因。在某些实施方式中，所述非人动物中的人免疫球蛋白轻链可变区基因与内源性免疫球蛋白轻链可变区基因之间的距离为4kbp-42kbp。

21、在某些实施方式中，所述非人动物为哺乳动物。在某些实施方式中，所述非人动物为啮齿动物。在某些实施方式中，所述非人动物为小鼠。在某些实施方式中，所述非人动物为野鼠。

22、在某些实施方式中，所述小鼠在基因座的tmem121与igha基因之间插入人免疫球蛋白重链可变区基因。在某些实施方式中，所述小鼠在染色体位置chr12：113,149,523～113,223,857之间插入人免疫球蛋白重链可变区基因。在某些实施方式中，所述小鼠在染色体位置chr12：113,190,256处插入人免疫球蛋白重链可变区基因。

23、在某些实施方式中，所述小鼠在基因座的lgkc和rpia基因之间插入人免疫球蛋白轻链可变区基因。在某些实施方式中，所述小鼠在染色体位置chr6：70,703,738～70,742,704之间插入人免疫球蛋白轻链可变区基因。在某些实施方式中，所述小鼠在染色体位置chr6：70,706,267处插入人免疫球蛋白轻链可变区基因。

24、在某些实施方式中，所述方法包括通过定点重组使得在所述非人动物的免疫球蛋白基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白可变区基因。在某些实施方式中，定点重组可以是一次或多次。在某些实施方式中，所述方法包括使用多次定点重组连接多个人重链v、d或j区或其片段的基因。在某些实施方式中，所述方法包括使用多次定点重组连接多个人轻链v或j区或其片段的基因。在某些实施方式中，所述定点重组包括：同源重组法、核酸切割酶介导重组法、位点特异性重组酶介导的重组。在某些实施方式中，使用携带人类基因组片段的载体将人免疫球蛋白可变区基因插入所述非人动物的免疫球蛋白基因座下游。在某些实施方式中，使用位点特异性重组系统介导的定点整合方法将人免疫球蛋白可变区基因插入所述非人动物的免疫球蛋白基因座下游。在某些实施方式中，所述方法包括在插入人免疫球蛋白可变区基因之后，删除抗性标记。

25、在某些实施方式中，所述方法包括，在插入人可变区基因之前，通过染色体重组使得所述非人动物的免疫球蛋白恒定区基因与内源性免疫球蛋白可变区基因的转录方向相反。在某些实施方式中，所述方法包括，在插入人可变区基因之前，通过染色体重组倒转所述非人动物的免疫球蛋白恒定区基因的转录方向。在某些实施方式中，所述染色体重组包括位点特异性重组系统介导的基因组片段倒转。在某些实施方式中，所述方法包括在染色体重组之后，删除抗性标记。

26、另一方面，本技术提供了一种非人动物细胞，其在基因组包含免疫球蛋白基因座下游可操作地连接人免疫球蛋白可变区基因。在某些实施方式中，所述细胞为胚胎干(es)细胞。在某些实施方式中，所述细胞为生殖细胞。在某些实施方式中，所述细胞为受精卵细胞。在某些实施方式中，所述细胞为胚胎细胞。

27、在某些实施方式中，所述非人动物细胞可以发育为非人动物。

28、另一方面，本技术提供了源自所非人动物的细胞、组织和器官。

29、另一方面，本技术提供了一种制备与抗原特异性结合的抗体的方法，所述方法包括，用抗原免疫本技术所述的非人动物。

30、另一方面，本技术提供了一种制备与抗原特异性结合的抗体的方法，所述方法包括：将所述的非人动物或细胞暴露于所述抗原，从所述动物收集的细胞产生杂交瘤。所述方法还可以包括，收集由所述杂交瘤产生的所述嵌合抗体。所述方法可以进一步包括对所述杂交瘤的可变区基因进行测序。

31、另一方面，本技术提供了一种制备与抗原特异性结合的抗体的方法，所述方法包括：将所述的非人动物或细胞暴露于所述抗原，对所述动物或细胞中编码人重链和轻链免疫球蛋白可变区的核酸进行测序。所述非人动物或细胞可以表达与所述抗原特异性结合的嵌合抗体。在一个实施方式中，所述方法可以包括，将编码所述人重链免疫球蛋白可变区的核酸与编码重链免疫球蛋白恒定区的核酸可操作地连接，并表达所述抗原特异性结合的抗体。所述恒定区可以是人重链恒定区，也可以是非人动物的重链恒定区。在一个实施方式中，所述方法可以包括，将编码所述人轻链免疫球蛋白可变区的核酸与编码轻链免疫球蛋白恒定区的核酸可操作地连接，并表达所述抗原特异性结合的抗体。所述恒定区可以是人轻链恒定区，也可以是非人动物的轻链恒定区。

32、另一方面，本技术提供了一种制备样品的方法，所述方法包括：将本技术所述的非人动物暴露于抗原；以及从所述非人动物收集所述样品。在某些实施方式中，所述样品包括免疫细胞，例如b细胞。在某些实施方式中，所述样品包括骨髓、脾组织、淋巴结、脾细胞或外周淋巴细胞。

33、本技术的技术方案包括以下一种或多种优势：

34、本技术所述的非人动物在避免干扰动物本身基因表达及调控上具有优势。例如，将人可变区基因(例如，轻链可变区，重链可变区，或轻链可变区和重链可变区)插入在小鼠细胞的内源性免疫球蛋白基因座下游(或后面)，避免在非人动物(例如，小鼠)内源性免疫球蛋白基因座内插入大片段dna序列或删除dna序列。由于非人动物(例如，小鼠)内源性免疫球蛋白基因座下游存在非常长的“junk序列”，如根据最近公示的grcm39小鼠全基因组序列参考，小鼠免疫球蛋白重链基因下游(后方)有长达66kb碱基的无功能性基因报道的序列，小鼠免疫球蛋白κ轻链基因下游(后面)有长达39kb碱基的无功能性基因报道的序列。在这些长“junk序列”内引入外源大片段基因可以从基因组层面避免干扰非人动物(如小鼠)内源性基因的表达及调控。

35、本技术所述的非人动物在避免干扰动物本身基因表达及调控上还具有优势。例如，避免对非人动物(例如，小鼠)免疫球蛋白基因可变区进行修饰或删除。由于非人动物(例如，小鼠)内源性免疫球蛋白可变区基因座内部不乏功能性蛋白编码基因和功能性microrna基因，这些基因的删除或修饰或造成动物本身出现不可预知的表型。如小鼠免疫球蛋白重链基因座内含有功能性蛋白编码基因adam6a，而adam6a基因的修饰或删除会导致小鼠雄性不育。

36、本技术所述的非人动物在产生抗体上具有优势。在本技术所述的非人动物中，宿主非人动物免疫球蛋白可变区基因和恒定区基因均被保留，即，非人动物的内源性免疫球蛋白可变区基因和恒定区基因均被保留。其中所有的宿主免疫球蛋白调控序列，包括启动子、增强子、转换区以及其他潜在表达调控序列，均被保留。由此能够更好的确保所述非人动物中免疫球蛋白基因重组、表达，b细胞发育、亲和力成熟等。

37、本技术所述的非人动物在产生抗体上具有优势。例如，在一些实施方案中，将动物内源性免疫球蛋白恒定区全部或部分修饰(例如，将恒定区全部或部分倒置)，使其与内源性可变区基因转录方向相反。避免了内源性可变区与内源性恒定区发生v(d)j重组产生抗体。

38、本技术所述的非人动物在产生抗体上还具有优势。例如，在一些实施方案中，插入的外源人免疫球蛋白可变区远离内源性可变区，并与之转录方向相反。避免内源性可变区由于dna重组酶修改重组整合到人可变区vdj重组或vj重组中去，进而很大可能地避免了由内源性可变区谱系带来的在人中具有免疫原性表位的抗体的产生。

39、本技术所述的非人动物在产生抗体上还具有优势。例如，在一些实施方案中，将人可变区基因的全部片段分次逐步引入插入在非人动物(例如，小鼠)细胞的内源性免疫球蛋白基因座下游(后面)，获得的非人动物产生的可变结构域可具有与人中的可变结构域的多样性几乎一样的多样性。这也意味着获得的非人动物具有尽可能接近人体本身的抗体多样性以及获得高亲和力特异性抗体的可能性。

40、本技术所述的制备非人动物的方法也具有优势。例如，在一些方案中，将非人动物(例如，小鼠)内源性免疫球蛋白恒定区全部或部分修饰，使其与内源性可变区基因转录方向相反。再将经修饰的人可变区基因插入在非人动物(例如，小鼠)细胞的内源性免疫球蛋白基因座下游(后面)，人可变区基因可以从后往前分段且与动物免疫球蛋白基因座转录相反方向插入。获得的效果是，几乎每一段插入获得的部分的人可变区的修饰细胞都可以注射到动物早期胚胎中以制备嵌合动物(例如，小鼠)，产生的或经育种获得的非人动物。获得的非人动物都能利用插入的部分人可变区基因进行vdj或vj重组，并产生功能性人可变区的嵌合抗体。这些携带有部分人可变区的非人动物可作为制作最终具有完整人可变区非人动物的检查点(check point)。从抗体产生层面和可变区结构域多样性上判断人可变区分段插入的可靠性及功能性，对具有完整人可变区非人动物的制作及时做出成败预判和路线修正。这些携带有部分人可变区的非人动物也可用抗体发现，进行人可变区嵌合抗体的生产。

41、本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。