一种蜱源组胺结合蛋白HqHBP及其编码基因在抗过敏反应中的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种蜱源组胺结合蛋白hqhbp及其编码基因在抗过敏反应中的应用。

背景技术：

1、作为人类和动物最重要的吸血寄生虫之一，蜱在进食血液时会引发过敏性炎症、瘙痒和疼痛等病理反应。组胺是一种多效生物胺，参与包括神经传递、免疫反应、营养以及细胞生长和分化等关键生理过程。作为一种众所周知的过敏性炎症介质，组胺在机体对某种物质过敏时释放。组胺还会在宿主体内引发疼痛和瘙痒的感觉。已知组胺不仅会对蜱附着在宿主皮肤的能力产生不利影响，还会直接或间接降低其进食和繁殖的成功率，因此，蜱进化出了有效的策略来应对宿主的免疫防御反应。脂蛋白是一类在蜱吸血过程中分泌的小分子。组胺结合蛋白（hbps）是蜱分泌的一种脂质结合蛋白，可以通过特异性结合组胺来发挥作用。例如，附尾扇头蜱（ rhipicephalus appendiculatus）可以将组胺结合蛋白分泌到伤口部位，以抑制过敏性炎症反应。网纹革蜱（ dermacentor reticulatus）的组胺结合蛋白shbp具有两个结合位点，一个结合组胺，另一个结合血清素（或5-羟色胺–5-ht）。此外，来自陌湖锐缘蜱（ argas monolakensis） 、翘缘锐缘蜱（ argas reflexus） 、塞氏钝缘蜱（ ornithodoros savignyi）和肩突硬蜱（ ixodes scapularis）的蜱脂蛋白已被表征为组胺和/或5-ht结合蛋白。这些 hbps 会局部捕获分泌的组胺分子，防止其到达靶细胞。

2、迄今为止，用于治疗过敏性疾病的各种药物通常伴随着诸如溃疡、镇静和心悸等各种副作用。天然的生物活性物质及其衍生物是新药开发的重要来源，许多来源于自然的药物已在临床实践中使用，蜱唾液越来越被认为是具有特定功能的生物活性分子的丰富来源。在本研究中，我们成功克隆了青海血蜱（ haemaphysalis qinghaiensis） 唾液腺的一个新基因 hq018。在原核表达系统中成功表达了重组蛋白 hqhbp 。实验结果表明，重组的蛋白 hqhbp 具有高效的组胺结合活性。

技术实现思路

1、本发明新发现的青海血蜱hqhbp蛋白，该蛋白通过结合蜱叮咬部位宿主产生的组胺，抑制局部的痛觉及过敏性炎症反应，降低宿主对局部疼痛的感知以及蜱长期吸血造成的过敏反应，以帮助蜱成功吸血；该蛋白因其特异性的组胺结合功能，能够抑制局部组织的过敏性炎症反应，可用于制备抗过敏反应制剂。

2、本发明第一个方面公开了一种蜱的组胺结合蛋白hqhbp，所述组胺结合蛋白为青海血蜱的唾液腺来源的重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、mqvfvllmfvgsfshaytnppgaisssqtttcttgpleeqdgweflkrqtpmlvamrnfdtnysithqtdcifpittksdrrklqisqnylvhsqkpdewvtfekhftakkevdkeachvfssrhegeprdytigysselclvvhlprnlygvqtpcellvrpryfrnkdreccgyyfntlcggdgrivsnkrscygltkqeaekkveelrraasss（seqid no.1）。

4、本发明除了保护上述组胺结合蛋白hqhbp，进一步地，本发明还应保护在上述蛋白的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

5、以及经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与本发明组胺结合蛋白相近功能的多肽或蛋白分子；或来源于青海血蜱且与组胺结合蛋白hqhbp具有98％以上同源性且与过敏及抗炎相关的蛋白质。

6、本发明第二个方面公开了编码上述组胺结合蛋白或类似物的核酸分子，其中胺结合蛋白hqhbp的编码核酸分子hq018的序列如seq id no.2所示。

7、gcggttggtctgacgcttgcaaagaaagcgtcctattttgttgaaatgcaggtcttcgtccttctcatgttcgttggttctttcagccatgcatatacgaaccctcccggagccatttcgtcctcccaaactactacctgtacaactggccccctggaggagcaagatggatgggagtttcttaaaagacagacgccaatgctggtggctatgagaaatttcgatacaaactactccatcacgcaccagacagactgcattttccccatcaccacgaaatctgacaggagaaagctacagatatctcaaaattacctcgtccacagccaaaagcctgacgaatgggttacatttgaaaaacattttacggcgaaaaaagaagtggacaaggaagcatgtcatgtattttcttctcggcatgaaggggaaccaagagattatactattggatactccagtgaactttgcctcgtagtacatctgcctagaaatctctatggtgtacaaacgccatgcgagctactcgtcagacctcggtatttcagaaataaagaccgcgaatgctgcggatattatttcaataccttgtgtggcggcgatggtcgcattgtttcaaacaagcgatcctgctatgggctcaccaaacaagaagctgaaaaaaaagtcgaagaactgcgacgagccgcgtcttcgtcataatgaacccttaatgtccatttatctgtcaaaataaactatgcttcaaagtaaaaaaataaaaaagaagataacaaaaa（seq id no.2）

8、如seq id no.2所示基因序列中的46位至699位的核苷酸序列翻译得到如seq idno.1所述氨基酸序列的蛋白，其中seq id no.2所示基因序列中46位至699位的核苷酸序列，其结尾处的碱基taa为终止密码子。

9、上述核酸分子为青海血蜱的组胺结合蛋白hqhbp的编码基因hq018。本发明所公开的核苷酸序列属于首次公开，在现有技术的检索中未发现与其有相似性的同源序列。

10、在本发明中，本领域技术人员公知的是，由于蛋白质遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法（如pcr方法、突变方法）或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此，该部分核苷酸序列都应该包括在本发明保护范围内。

11、本发明利用本领域常用的报道基因与本发明的基因相连获得开放阅读框架。优选地，所述开放阅读框还包括启动子和/或增强子。

12、本发明第三个方面公开了一种包含上述青海血蜱组胺结合蛋白hqhbp编码基因hq018的重组载体。

13、在本发明中，所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可以为重组表达载体。优选地，所述重组载体为重组表达载体。进一步优选地，所述重组表达载体选自重组原核表达载体中的任意一种。在本发明的一种优选的实施方式中，所述重组载体为将本发明提供的基因与原核表达载体pet30a连接构建得到的重组载体。

14、其中所述“载体”指的是dna构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的dna序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体等。

15、本发明第四个方面公开了一种重组微生物宿主细胞，包含上述的重组载体；所述重组微生物宿主细胞优选为大肠杆菌。

16、重组微生物宿主细胞具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(capo4 )沉淀法、氯化钙(cacl2 )沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法等。

17、所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选大肠杆菌。所述宿主细胞可以是任何菌株，只要该菌株具有生产重组蛋白hqhbp的能力，其包括野生型菌株和重组菌株。

18、本发明第五个方面公开了上述组胺结合蛋白的制备方法，包含以下步骤：

19、s1、设计引物，以青海血蜱cdna文库中所获阳性克隆hq018作为pcr反应的模板进行pcr扩增，得hq018基因；

20、s2、将s1所得hq018基因插入pgem-t-easy载体，构建重组克隆质粒；

21、s3、将s2所得阳性克隆菌进行扩大培养并提取重组克隆质粒；

22、s4、将s3获得的重组克隆质粒和原核表达载体pet30a分别利用限制性内切酶 nde i和 xho i进行酶切，获得目的基因插入片段和线性化载体；

23、s5、将s4所获插入片段和线性化载体用t4连接酶连接，构建重组原核表达质粒pet30a-hq018，用所构建的重组原核表达质粒转化感受态细胞dh5α，并提取重组表达质粒；

24、s6、将s5测序验证正确的重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞rosetta（de3），经卡那霉素抗性筛选后，对诱导表达的蛋白质进行纯化，得到重组蛋白hqhbp。

25、本发明中的基因hq018是从蜱的唾液腺cdna文库中克隆得到的，基因序列长度为776bp, 基因序列含有一个长度为654bp（46位至699位）的开放阅读框架（orf），编码的氨基酸序列长度为217aa，理论分子量为25kda，等电点pi为8.05。将去掉信号肽后的编码序列与pet30a表达载体连接构建重组表达质粒，将质粒转化至大肠杆菌rosetta（de3），诱导表达获得重组蛋白hqhbp。所表达的重组蛋白的羧基端引入了lehhhhhh纯化标签，该重组蛋白含有210个氨基酸残基，理论分子量为24.4kda, 等电点pi为7.88。以纯化的重组蛋白进行体外elisa实验，体内二甲苯诱导的炎症模型实验，证实蜱源组胺结合蛋白hqhbp分子具有特异性结合组胺及抗水肿的生物活性，可用于制备抗过敏反应制剂。

26、优选地，s1中，所述引物的核苷酸序列如seq id no .3和seq id no .4所示。

27、本发明第六个方面公开了上述的组胺结合蛋白hqhbp、上述的核酸分子hq018、上述的重组载体或上述的重组微生物宿主细胞在制备抗过敏药中的应用。所述抗过敏药用于过敏反应的治疗与缓解。

28、本发明第七个方面公开了一种抗过敏药，包含上述的组胺结合蛋白hqhbp和药学上可接受的载体，其中组胺结合蛋白hqhbp作为抗过敏药的活性成分。

29、与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：

30、本发明的青海血蜱组胺结合蛋白hqhbp，经重组表达后获得hqhbp重组蛋白，将纯化的目标蛋白进行体外elisa实验，测量450 nm处的吸光度，结果显示该蛋白可以特异地结合组胺。该蛋白可以显著减轻二甲苯诱导的小鼠炎症模型的耳水肿，可以直接减少二甲苯诱导的皮肤炎症组织中组胺的含量。该组胺结合蛋白适用于研制抗过敏反应制剂。