一种B族链球菌的快速检测方法、试剂盒和系统

本发明涉及医疗器械领域，更具体的说，它涉及一种用于病原体体外诊断的poct检测设备。

背景技术：

1、b族链球菌(group b streptococcus，gbs)是导致新生儿感染的主要病原体。孕妇消化道和泌尿生殖道gbs定植是新生儿早发型gbs病(gbs early-onset disease，gbs-eod)的主要危险因素。约50％gbs定植的孕妇会将细菌传播给新生儿。若产时未预防性静脉应用抗生素，1％～2％的新生儿会发生gbs-eod。目前“预防围产期b族链球菌病(中国)专家共识”建议对所有孕35～37周的孕妇进行gbs筛查。

2、单行naat耗时短(1～2h)，可用于未行gbs筛查孕妇在产程中即时检测。然而，以荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qpcr)为代表的常规naat方法的灵敏度仍不足，在缺少增菌培养的情况下，检出失败率为7％～10％。更重要的是，qpcr通常需要进行1h的核酸提取和1.5-2h的热循环核酸扩增，在临床上尤其是早产时存在急产的情况，检测时间仍不能保证在胎儿娩出前出结果。

3、单一使用lamp检测技术进行gbs筛查时，由于使用染料作为最后检测结果的显色方式，所以lamp的结果判读只有扩增与不扩增两种，一旦发生非特异性扩增，难以区分。并且由于其引物设计的特殊性，导致其适用性低，敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。单一crispr检测技术进行gbs筛查时，由于待检样本未进行核酸扩增，导致检测灵敏度的降低，可能存在脱靶效应，造成误检、漏检现象，检测时间也会延长。唯有将二者合理结合，才能取得最佳的检测效果。此外，研究表明，很多严重感染gbs的婴儿都是在建议筛查时间之前早产的，对床边快速测定有更高的要求。因而需要一种更高效快速的gbs检测试剂盒能够更好的针对临产时gbs结果未回进行处理，极短时间(1h)内明确gbs定植情况，帮助临床预防新生儿gbs感染，同时避免抗生素的滥用导致的毒副反应、出现耐药病原体、二重感染或交叉感染、免疫力低下等情况出现。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种基于环节导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术，crispr/cas12b(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats-cas12b)技术和免核酸提取技术的快速b族链球菌(gbs)检测方法、试剂盒及检测装置。

2、一种b族链球菌快速检测试剂盒，包括：

3、i：检测b族链球菌cfb基因的lamp混合液，其中lamp引物以b族链球菌编码特异性溶血性致病物质camp因子的cfb基因上的保守序列为靶标；ii：crispr/cas12b混合液，其中包含seq id no.7所示的crrna，以及ssdna荧光报告分子：5′-fam-ttatt-bhq1-3′。crrna依据lamp扩增产物序列设计，并在pam位点(ttn)附近，并避免与lamp互补配对，造成结果的假阳性。ssdna报告分子依据cas12b反式切割碱基偏好特异性设计，并在5′端加入荧光基团fam，在3′端加入荧光猝灭基团bhq1。

4、作为本发明的一种优选，所述的试剂盒还包含dna快速释放液体系；所述的dna快速释放液体系组成为氢氧化钠0.8％～1.2％(g/ml)，sds1％～1.2％(w/v)，tween 201％～1.2％(v/v)和无酶无菌水。

5、作为本发明的一种优选，所述的lamp混合液中含有如下6条六条特异性引物：

6、lf 5′-atcatatgtgtaacgttcat-3′(seq id no.1)，

7、lb 5′-tgtattagaagtacatgctg-3′(seq id no.2)，

8、f35′-gccctgtaaattaaaaatactgc-3′(seq id no.3)，

9、b35′-gcttttgagccatttgct-3′(seq id no.4)，

10、fip 5′-agccactagagttccagatagatac-agaagtgattttagtttaa aggagg-3′(seq idno.5)

11、bip 5′-ggtgcattgttattttcaccagc-ctatttacatgatttaccactt gtg-3′(seq idno.6)

12、作为本发明的一种优选，所述的lamp混合液组成为：1×等温扩增缓冲液，7～10mmmgso4，每个dntp各1～1.5mm，4～5u bst dnapolymerase，其中，各引物的摩尔浓度如下：f3和b3的摩尔浓度均为0.1～0.3μm，fip和bip的摩尔浓度均为1.5～1.8μm，lf和lb的摩尔浓度均为0.3～0.5μm。

13、作为本发明的一种优选，所述的crispr/cas12b混合液组成为180～200nmaapcas12b，350～420nm crrna，900～1100nm ssdna荧光报告分子和1×neb r3.1缓冲液。

14、本发明还公开了一种快速检测b族链球菌的系统，包含本发明所述的b族链球菌快速检测试剂盒及b族链球菌检测装置，所述检测装置包括壳体，恒温孵育模块，电源模块，荧光分析模块，壳体包括主体和顶盖。顶盖可拆卸，用于检测样本的加入，加入置于内部试管架中，所述电源模块由电池构成，为恒温孵育模块和荧光分析模块供电。所述恒温孵育模块由ptc加热膜构成满足分子诊断学的检测要求。所述荧光分析模块由滤镜模块和光学模块构成，透镜将光聚焦并平均分配于整个装置的内腔中，激发荧光，并通过滤镜模块进行荧光信息读取。

15、进一步的，所述壳体为矩形盒状，包括主体和顶盖，壳体尺寸长宽高具体为80mm*68mm*70mm。

16、进一步的，所述顶盖尺寸为13mm*33mm*80mm，顶盖和主体连接通过多组均匀分布的钕磁铁完成。

17、进一步的，所述的加热模块上方覆盖有内部试管架，内部试管架均匀分布在一块长80mm宽33mm的矩形板块上，共有7个直径为6.8mm的试管孔洞

18、进一步的，所述恒温孵育模块为由ptc加热板构成，额定功率为0.5～1.5w，可维持温度为60±2℃，长度为61mm*25mm*3mm。

19、进一步的，还所述电源模块由三节1.5v电池构成。

20、进一步的，所述荧光分析模块由滤镜模块和光学模块构成

21、进一步，所述滤光模块由琥珀色滤光片构成，过滤波长为460～480nm，进一步优选过滤波长为470nm，其尺寸为长57mm，宽14mm，高5mm。

22、进一步的，所述光学模块包括由光学灯组和透镜模块构成，光学灯组由灯光波长为460-470nm的led灯构成，透镜模块由一块直径为16毫米、焦距为3毫米、工作距离为3毫米数值孔径为0.7毫米的透镜构成。

23、本发明有益效果为：

24、免提取检测，b族链球菌dna快速释能够取得和dna提取同样的检测效果。并且由于因反复离心弃去原液的成分，更能在检测到低拷贝样本上表现出优势。

25、高灵敏度，在lamp扩增后，进行crispr/cas12b反式切割测定，能够二次放大信号，达到单拷贝水平，满足临床的灵敏检测需求。

26、快速，从取样到观察结果，整个操作过程可以控制在45分钟内，尤其满足产科临产的紧急检测需求。