一种降低植物白粉菌抗病性的蛋白质及其应用

本发明属于生物农业领域，具体涉及一种降低植物白粉菌抗病性的蛋白质及其应用。

背景技术：

1、为了抵御病原菌的侵染，植物进化出了多层次并且相互关联的先天免疫系统。首先，定位于植物细胞膜的模式识别受体(pattern recognition receptor，prr)识别病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，pamp)，激活pti（pattern-triggered immunity），对大多数病原菌的侵染产生抵抗作用，病害便无从发生[1-2]。pti的产生引发一系列基础防御反应，包括细胞活性氧爆发、被侵染部位细胞壁上的胼胝质沉积、丝裂原蛋白激酶的激活以及病程相关基因的表达，例如 pr1（pathogenesis related 1）， frk1(flg22-induced receptor-like kinase 1)以及 wrky转录因子等[3-4]。为了抑制植物pti免疫反应，一些病原菌向宿主细胞分泌大量的效应蛋白（effector proteins）以干扰免疫进程，使植物感病。相应地，植物进化出第二层次的免疫系统，利用自身的抗性基因（resistance gene）识别病原菌效应蛋白，从而激发eti（effector-triggered immunity），通常伴有大量的细胞死亡（cell death），使病原菌的侵染局限在一定部位[5-6]。

2、白粉病是影响植物生长的常见病害之一，对多种农作物造成危害，如小麦、葡萄、大豆、甜瓜、大麦等[7]。引起白粉病的病原物是白粉菌（powdery mildew），属于子囊菌门，白粉菌目。白粉菌是一种专性活体寄生真菌，需要活的宿主细胞才能生存，不能进行离体培养，其生命周期的所有步骤包括产孢、孢子积累和萌发等都发生在活体组织上[8-9]。在与寄主植物互作过程中，产生侵入钉穿透叶片表皮细胞并形成吸器，吸收寄主植物体内水分和营养物质。同时，白粉菌通过吸器分泌大量的效应蛋白到植物细胞内，抑制植物的先天免疫反应从而实现在寄主植物上的成功侵染。对一些相近的禾本科布氏白粉菌（grass powderymildew）进行基因组、转录组和蛋白质组测序分析，鉴定出大约350-800个潜在的分泌效应蛋白（candidate secreted effector proteins，cseps）[10-15]。目前，仅有少数效应蛋白的作用机理被挖掘，利用寄主诱导的基因沉默技术（host-induced gene silencing，higs）和转基因过表达方法，发现接近20个大麦白粉菌效应蛋白可以发挥毒性功能，促进白粉菌的侵染[16]，14个效应蛋白可以被寄主抗性基因识别，激发抗病反应[17]。橡胶树（ heveabrasiliensis）白粉病是影响天然橡胶产量的重要病害之一。橡胶树白粉菌（ oidiumheveae）主要侵染橡胶树新叶、花朵等未成熟组织，发病严重时，橡胶树整个叶面被菌丝覆盖，导致大面积落叶和冠层枯竭。通过对橡胶树白粉菌小种ho-73基因组和转录组测序分析，鉴定出133个候选效应蛋白[18]。其中，效应蛋白csep01276可以干扰植物体内环氧类胡萝卜素双加氧酶细胞定位，抑制脱落酸的合成，促进白粉菌的侵染[19]。效应蛋白csep04187被植物识别，在拟南芥、烟草以及橡胶树原生质体中激发抗病反应[20]。然而，大多数橡胶树白粉菌效应蛋白的作用机理是什么，目前仍然是未知的。

3、橡胶树原产于巴西，遗传资源有限，目前尚未发现对橡胶树白粉菌具有抗病性的遗传小种，并且橡胶树是大戟科橡胶树属大乔木，难以进行遗传操作，具有操作周期长、难度大等特点，严重阻碍了二者互作机制的研究。最近研究发现，橡胶树白粉菌在拟南芥激发抗病反应[21]，同时拟南芥 tir-nb-lrr（toll-interleukin1 receptor-nucleotidebinding-leucine-rich repeat)类抗性基因 wrr4b（white rust resistance 4b）参与对橡胶树白粉菌的部分抗病性[22]，这为深入研究橡胶树白粉菌的致病机理提供了线索和工具。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病性。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：

3、d1）调控植物抗病性；

4、d2）制备调控植物抗病性的产品；

5、d3）培育抗病性改变的植物；

6、d4）制备培育抗病性改变的植物的产品；

7、所述蛋白质来源于橡胶树白粉菌 oidium heveae，其名称为csep03399，csep03399为如下a1）、a2）或a3）：

8、a1）氨基酸序列是seq id no.3的第31-192位的蛋白质；

9、a2）将序列表中seq id no.3的第31-192位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

10、a3）在a1）或a2）的n端或/和c端连接标签得到的蛋白质。

11、上述a2）中的csep03399蛋白质，为与seq id no.3的第31-192位所示蛋白质的氨基酸序列具有75%或75%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。所述具有75%或75%以上同一性为具有75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

12、上述a2）中的csep03399蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

13、上述a2）中的csep03399蛋白质的编码基因可通过将seq id no.2的第91-576位所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。其中，seq id no.2的第91-576位所示的dna分子编码seq id no.3的第31-192位所示的蛋白质。

14、a3）中所述标签可为利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为信号肽、poly-arg、poly-his、flag、strep-tag ii、c-myc、mbp标签、ha标签、gst标签和/或sumo标签等。

15、上述a3）所述蛋白质可为氨基酸序列是seq id no.3的蛋白质。

16、上述应用中，所述物质可为下述b1）至b4）中的任一种：

17、b1）编码csep03399的核酸分子；

18、b2）含有b1）所述核酸分子的表达盒；

19、b3）含有b1）所述核酸分子的重组载体、或含有b2）所述表达盒的重组载体；

20、b4）含有b1）所述核酸分子的重组微生物、或含有b2）所述表达盒的重组微生物、或含有b3）所述重组载体的重组微生物。

21、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

22、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码csep03399蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的csep03399蛋白质的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码csep03399蛋白质且具有csep03399蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

23、上述应用中，b1）所述核酸分子可为如下b11）或b12）或b13）：

24、b11）编码序列是序列表中seq id no.2的第91-576位的dna分子；

25、b12）编码序列是序列表中seq id no.2的dna分子；

26、b13）与b11）或b12）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码csep03399的dna分子。

27、b11）所述dna分子为seq id no.2的第91-576位所示的dna分子。b12）所述dna分子可为seq id no.1或seq id no.2所示的dna分子。

28、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no.3的第31-192位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

29、上述75%或75%以上同一性，可为75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

30、上述应用中，b2）所述的含有编码csep03399蛋白质的核酸分子的表达盒（csep03399基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达csep03399蛋白质的dna，该dna不但可包括启动csep03399基因转录的启动子，还可包括终止csep03399基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、 器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子 35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（"lap", chao 等人（1999） plant physiol 120：979-992）；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关 1 （pr1）（由水杨酸和 bth（苯并噻二唑 -7-硫代羟酸 s-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂 ii启动子（pin2）或 lap启动子 （均可用茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利 5，187，267）；四环素诱导型启动子（美国专利 5，057,422）；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128（cn101063139b（中国专利200710099169.7）），种子贮存蛋白质特异的启动子（例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和 大豆 beta conglycin 的启动子（beachy 等人 （1985） embo j. 4：3047-3053））。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（nos终止子）、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见， 例如： odell 等人 （1985）nature 313:810； rosenberg等人（1987） gene, 56:125； guerineau等人 （1991） mol.gen. genet , 262:141 ; proudfoot （1991） cell, 64:671; sanfacon等人 genes dev., 5:141; mogen等人 （1990） plant cell, 2:1261； munroe等人 （1990） gene, 91:151；ballad等人 （1989） nucleic acids res. 17:7891； joshi等人 （1987） nucleic acidres., 15:9627）。

31、可用现有的表达载体构建含有所述 csep03399基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa、psn1301或pcambia1391-xb（cambia公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3´端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3´端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（ti）质粒基因（如胭脂碱合成酶基因 nos）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3´端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（ gus基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的 nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的 bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的 hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的 dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

32、上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为per8载体。

33、b3）所述重组载体具体可为per8-csep03399。所述per8-csep03399为将per8载体的 xho i和 bstb i识别序列间的dna片段替换为seq id no.2的第91-579位所示的dna片段得到的重组载体。

34、上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌gv3101。

35、上述应用中，所述抗病性可为对白粉菌的抗性。

36、在本发明的一个实施例中，所述白粉菌为橡胶树白粉菌。

37、上述应用中，所述调控csep03399含量或活性的物质可为提高csep03399的含量或活性，所述调控植物抗病性为降低所述植物的抗病性，所述培育抗病性改变的植物为培育抗病性降低的植物。

38、本发明还提供了下述任一方法：

39、x1）降低植物抗病性的方法，包括：提高受体植物中csep03399蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物，实现植物抗病性的降低；

40、x2）培育抗病性降低植物的方法，包括：提高受体植物中csep03399蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物。

41、具体的，x1）和x2）所述方法可通过向所述受体植物中导入csep03399的编码基因实现。

42、上述方法中，所述编码基因可为b1）所述核酸分子。

43、所述csep03399的编码基因可利用含有所述csep03399的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述per8-csep03399。

44、所述重组表达载体可通过使用 ti质粒，植物病毒载体，直接 dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（weissbach, 1998， method for plantmolecular biology viii, academy press, new york, pp.411-463; geiserson andcorey, 1998, plant molecular biology（2nd edition）.）。

45、所述目的植物理解为不仅包含csep03399基因的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

46、上文中，所述植物可为m1）-m6）中的任一种：

47、m1）双子叶植物或单子叶植物；

48、m2）木兰纲；

49、m3）茄目或十字花目；

50、m4）茄科或十字花科；

51、m5）烟草属或拟南芥属；

52、m6）烟草或拟南芥。

53、csep03399或所述调控csep03399含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。

54、本发明通过克隆橡胶树白粉菌候选效应蛋白基因 csep03399，构建在拟南芥野生型col-0背景下的转基因植株，发现过表达csep03399并不能在拟南芥和本氏烟激发可见的细胞坏死。接种橡胶树白粉菌后，与空载体转基因植物相比，橡胶树白粉菌在 csep03399转基因植株上可以形成浓密的菌丝网络和少量的分生孢子，并且激发的细胞死亡，活性氧产生以及 pr1基因表达也明显减弱，说明效应蛋白csep03399在拟南芥发挥毒性功能，促进白粉菌的侵染。进一步接种假单胞菌dc3000和dc3000 hrcc-，发现csep03399并不促进假单胞菌的细菌生长，同时，csep03399也不抑制dc3000 avrb和dc3000 avrrpt2以及拟南芥 tir- nb-lrr（toll-interleukin1 receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)类抗病基因 wrr4b（white rust resistance 4b）激发的超敏反应。利用几丁质处理空载体和 csep03399转基因植物后，通过q-pcr发现，csep03399可以抑制几丁质激发 frk1(flg22-induced receptor-like kinase 1)和 wrky22基因表达，说明csep03399可能通过抑制pti(pamp triggered immunity)信号通路发挥毒性。本发明的csep03399可用于制备白粉菌敏感植物，以筛选抗白粉菌药物。

55、下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。