一种鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的InDel标记及其应用

本发明涉及樱桃分子标记辅助种质资源鉴别与育种，具体为一种适用于鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的indel标记及其应用。

背景技术：

1、中国樱桃(cerasus pseudocerasus(lindl.)g.don)和欧洲甜樱桃(cerasusavium(l.)moench.)是目前我国主栽的两大果用樱桃种。两个樱桃种资源丰富，由于生长环境和发育时期差异，常常表型上呈现较多相似性，对中国樱桃和欧洲甜樱桃资源鉴定造成一定困扰。特别地，在种质特性方面，中国樱桃原产我国，适应性广，抗逆性强，在我国南方和北方均广泛栽培，果实鲜嫩多汁，风味浓郁，但果小，质地较软，不耐贮运；而欧洲甜樱桃需要一定的需冷量才能完成花芽分化和正常开花坐果，果实较大，质地较硬，耐贮运，主要在我国北方规模发展。因此，充分利用这两个樱桃种特性，杂交培育综合性状优良的突破性樱桃新品种，具有重要发展利用前景，而开发简单快捷、可靠性高的分子标记技术进行种质鉴定和育种材料的分子辅助选择可实现其高效利用。但是，由于中国樱桃为四倍体，基因组构成相对复杂；而欧洲甜樱桃为二倍体，基因组重复序列占比高，这些种质特性又极大地影响了从中国樱桃和欧洲甜樱桃基因组开发稳定、高效的分子标记。插入缺失(indel)是植物基因组中最为丰富的结构变异类型之一，为共显性标记，多态性高，重复性、通用性好，常用于作物种质鉴定、图谱构建、遗传多样性分析等研究。因此，对于多倍体中国樱桃和重复序列高的二倍体欧洲甜樱桃种质鉴定，基于全基因组开发高效、稳定、准确性高的indel分子标记，对鉴定中国樱桃与欧洲甜樱桃物种以及早期鉴定其种间杂交后代杂种真实性具有特别重要的意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术在具有复杂基因组物种的结构变异检测准确率低的缺点，提供一种用于鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的特异性indel标记及其应用。

2、一种用于扩增中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的indel标记的特异性引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物核苷酸序列为ggctaatccaaaattgccct，反向引物核苷酸序列为agggatgttggttctgatgg。

3、一种鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的indel标记，使用上述的特异性引物，以基因组dna为模板而扩增得到，所述中国樱桃的扩增产物为191bp，欧洲甜樱桃的扩增产物为173bp。

4、其中中国樱桃的扩增产物的第113位-第130位位置为5’-tgctattgccaaatgaag-3’，欧洲甜樱桃的扩增产物的第113位起缺失5’-tgctattgccaaatgaag-3’共18个碱基。

5、其中中国樱桃的扩增产物序列为：5’-ggctaatccaaaattgccctaattaataaaattaaaatccaagttaaaaaatacctttt cttgaagacatttttgttcttgcaatcttggtcagagatctcactcattgggctgctattg ccaaatgaagtaggtgattccaacatggtgttggggatgtggttatactctccatcagaaccaacatccct-3’，共191bp；

6、欧洲甜樱桃的扩增产物序列为：5’-ggctaatccaaaattgccctaattaataaaattaaaatccaagttaaaaaatacctttt cttgaagacatttttgttcttgcaatcttggtcagagatctcactcattgggctaggtga ttccaacatgatgttggggatgtggttatactctccatcagaaccaacatccct-3’，共173bp。

7、上述的特异性引物或indel标记在鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质中的应用。

8、所述的应用，使用特异性引物，以基因组dna为模板而扩增得到indel标记；其中所述中国樱桃的扩增产物为191bp，欧洲甜樱桃的扩增产物为173bp，中国樱桃与欧洲甜樱桃杂交品种的扩增产物有两个片段，分别为191bp和为173bp，所述的特异性引物为：

9、正向引物核苷酸序列为ggctaatccaaaattgccct，

10、反向引物核苷酸序列为agggatgttggttctgatgg。

11、其中基因组dna来源于叶片。

12、本发明获得了一种鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的indel标记，引物编号为cp2_35932912，包括正向引物和反向引物，所述indel标记正向引物核苷酸序列为ggctaatccaaaattgccct，反向引物核苷酸序列为agggatgttggttctgatgg。

13、本发明同时提供了indel引物cp2_35932912在中国樱桃和欧洲甜樱桃种质鉴定中的应用，包括以下步骤：

14、(1)基因组dna的提取：提取待测样本的基因组dna；

15、(2)分子标记的开发：将本发明中样本的全基因组重测序数据比对到中国樱桃洛阳古樱参考基因组(已上传至cngb数据库，accession number：cnp0006741)上，通过变异检测和位点过滤，从全基因组特异位点开发的引物中筛选出权利要求1中的indel引物用于后续试验和分析；

16、(3)pcr扩增：利用权利要求1中的indel引物对步骤(1)中得到的基因组dna进行pcr扩增；

17、(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染：将步骤(3)中获得的pcr产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后进行染色和显色，在凝胶成像系统上拍照；

18、(5)数据统计与带型分析：在quantity one软件中，以trans2k plus dna marker为参照，计算特异性条带大小(bp)，进行数据统计。根据特异性条带大小判定样本为中国樱桃或欧洲甜樱桃。最后对代表性个体的pcr产物进行sanger测序(生工)，对获得的序列进行比对，进一步检验变异检测、pcr扩增和电泳结果的准确性。由于‘兰丁2号’和‘考特’在该位点为杂合，因此对这两个样本进行五次独立的pcr扩增和sanger测序，用于复杂变异位点碱基类型的判定。

19、本发明中中国樱桃和欧洲甜樱桃种质鉴定应用的具体步骤如下：

20、(1)基因组dna的提取：采用基因组dna提取试剂盒(tianamp genomic dna kit)提取所有样本的基因组总dna，采用1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析以验证dna的完整性，并通过核酸蛋白定量分析仪(thermo scientific nanodrop分光光度计)检测各样本基因组dna的纯度和浓度；

21、(2)分子标记的开发：以中国樱桃洛阳古樱为参考基因组(已上传至cngb数据库，accession number：cnp0006741)，将184份中国樱桃和95份欧洲甜樱桃的全基因组重测序数据比对到参考基因组，利用gatk和sentieon进行变异检测，获得原始gvcf文件，提取indel文件从中筛选出中国樱桃和欧洲甜樱桃物种水平特异的indel位点，发现第2号连锁群的35932912位点在所有欧洲甜樱桃样本中存在18bp(5’-tgctattgccaaatgaag-3’)的缺失(deletion)。针对这一位点在primer 3中进行引物设计，获得上述indel引物用于后续试验和分析；

22、结合目标区域的全基因组重测序变异检测结果，预测中国樱桃扩增目标序列：5’-ggctaatccaaaattgccctaattaataaaattaaaatccaagttaaaaaatacctttt cttgaagacatttttgttcttgcaatcttggtcagagatctcactcattgggctgctattg ccaaatgaagtaggtgattccaacatggtgttggggatgtggttatactctccatcagaa ccaacatccct-3’，共191bp；

23、全基因组重测序变异检测结果表明，扩增目标序列区域中，除在第113位起存在目标缺失变异以外，在中国樱桃扩增序列的第148位，即欧洲甜樱桃扩增序列的第130位，相对于中国樱桃，欧洲甜樱桃还存在一个由g到a的碱基替换，因此欧洲甜樱桃预期扩增目标序列：5’-ggctaatccaaaattgccctaattaataaaattaaaatccaagttaaaaaatacctttt cttgaagacatttttgttcttgcaatcttggtcagagatctcactcattgggctaggtga ttccaacatgatgttggggatgtggttatactctccatcagaaccaacatccct-3’，共173bp。

24、(3)pcr扩增：利用权利要求1中的indel引物对步骤(1)中得到的基因组dna进行pcr扩增。pcr扩增体系(20μl)：dna模板1μl，正、反引物各1μl，ddh2o 7μl，taq mix(vazyme)10μl；扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸110s，共进行34个循环，最后72℃延伸8min，12℃forever；

25、(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染：将步骤(3)中获得的pcr产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上，电压1000v，电流50ma，功率50w下电泳3h，随后将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶在0.1％的agno3溶液中银染10min，取出凝胶利用蒸馏水冲洗胶面至浅乳白色，置于naoh和甲醛显色液中显色6min，最后在凝胶成像系统上拍照记录；

26、(5)数据统计与带型分析：在quantity one软件中，以trans2k plus dnamarker为参照，计算特异性条带大小(bp)，进行数据统计。产生191bp电泳条带的样本判定为中国樱桃，产生173bp条带的样本则判定为欧洲甜樱桃，同时具有191bp和173bp电泳条带样本则判定为中国樱桃和欧洲甜樱桃的杂种。同时，选择4个中国樱桃、4个欧洲甜樱桃和2个欧洲甜樱桃×中国樱桃杂种后代的pcr产物进行sanger测序(生工)，对测序核苷酸序列进行比对分析，进一步检验变异检测、pcr扩增和电泳结果的准确性。由于‘兰丁2号’和‘考特’在该位点为杂合，因此对这两个样本进行五次独立的pcr扩增和sanger测序，用于复杂变异位点碱基类型的判定。

27、步骤(2)中pcr扩增正向引物核苷酸序列为ggctaatccaaaattgccct，反向引物核苷酸序列为agggatgttggttctgatgg。

28、本发明具有如下的优点和有益效果：

29、(1)本发明获得了一种能在物种水平上高效且稳定地鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质的indel标记。通过pcr扩增，仅以一对引物成功实现了68份中国樱桃种内杂交f1子代、中国樱桃栽培种质与中国樱桃野生种质及30份欧洲甜樱桃栽培种质与欧洲甜樱桃野生种质的快速鉴定，准确率达到100％，操作方法简单、准确度高、成本低、重复性好，是目前在物种水平上鉴定中国樱桃和欧洲甜樱桃种质最简便，最快速，最准确的方法。

30、(2)本发明标记引物cp2_35932912扩增出的目的片段是中国樱桃物和欧洲甜樱桃在物种水平上相对双方各自特有的核苷酸序列，准确鉴定出了二者的三倍体杂种后代，为中国樱桃和欧洲甜樱桃种间分子辅助育种提供高效的种质鉴定分子标记。这对不同倍性水平且基因组高度杂合的多年生木本果树的种质资源的发掘利用具有重要意义。