一种用于培养十足目虹彩病毒的昆虫卵巢组织细胞系sfo-25及其构建方法与流程

本技术涉及水生生物细胞及水产养殖病害防控领域，尤其涉及一种用于培养十足目虹彩病毒的昆虫卵巢组织细胞系sfo-25及其构建方法。

背景技术：

1、罗氏沼虾（ macrobrachium rosenbergii）是世界上最大的淡水虾类之一，原产于整个南亚和东南亚地区以及大洋洲北部和西太平洋岛屿。自1976年从日本引进罗氏沼虾以来，经过40多年的发展与完善，我国的罗氏沼虾养殖业从无到有，已成为渔民增收致富的重要产业。但随着养殖规模的不断扩大及养殖环境恶化，病害已成为制约这几个品种产业发展的一大瓶颈，尤其是十足目虹彩病毒病，具有发病快、死亡率高、危害品种广、传播迅速等特点，给罗氏沼虾养殖业造成了巨大的经济损失。2019年，国际病毒分类委员会将危害南美白对虾、罗氏沼虾等的虾血细胞虹彩病毒和源自红螯螯虾的红螯光壳螯虾虹彩病毒归类为十足目虹彩病毒属，命名为十足目虹彩病毒1（decapod iridescent virus 1，div1）。div1主要流行于5~6月，可感染所有大小的虾，体长4~7 cm虾体内病毒的检出率最高。感染div1后，对虾的行动缓慢并且活力急剧下降，表现出明显的外部症状，主要包括虾体虚弱、头胸甲下可见白色三角区（常被称作“白头”或“白点”）、空胃空肠、虾壳变软、肠道发红甚至断裂、肝胰脏苍白萎缩。该病毒传播速率快、宿主范围广，主要暴发于浙江、广东和江苏等沿海养殖地区，患病虾类的病毒检出率、死亡率较高。给罗氏沼虾养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁该产业的健康发展。为此，中国发明专利cn202210749728.9公开了一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内感染的十足目病毒1的热激处理方法，通过36°c的热激方法降低div1病毒的活性，以此达到治疗的目的。同时，中国发明专利cn202211367931.6公开了一种基于era技术的十足目虹彩病毒1可视化快速检测方法及检测用引物和探针用于对div1病毒的特异性检测。

2、对于科研人员来说，目前仍通过活体动物实验来实现认识上述病毒、解析疾病的发病机制以及药物筛选。且上述活体动物实验具有以下缺陷：1、活体动物实验需要大型养殖场地和设备，受季节的影响，浪费了大量的成本和时间；2、活体动物实验不易控制实验条件，受外界气温、溶氧量以及动物病害的影响。

3、同时，中国发明专利cn202310578264.4公开了一种鳜鱼脊髓组织细胞系-37及其构建方法与应用，通过构建鳜鱼脊髓组织细胞系-37，对蛙虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒培养均有应用。上述专利虽然公开了构建细胞系，实现了从细胞培养层面对上述病毒的研究，但仅是针对鱼类，目前在虾类病毒培养中尚无稳定细胞系的构建，十足目虹彩病毒的体外细胞培养仍然是制约罗氏沼虾病害研究的一大难题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于培养十足目虹彩病毒的昆虫卵巢组织细胞系sfo-25，该昆虫卵巢组织细胞系sfo-25具有生长快，成本低且对十足目虹彩病毒敏感的优点。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、一种用于培养十足目虹彩病毒的昆虫卵巢组织细胞系sfo-25，其特征在于，由草地贪夜蛾卵巢组织细胞系传代培养得到。

4、作为优选，包括如下步骤：

5、（1）昆虫卵巢组织细胞系的传代：

6、取草地贪夜蛾卵巢组织细胞系进行复苏，使用1号培养液进行传代培养，传代至稳定，得到传代稳定后的昆虫卵巢组织细胞系，记为sfo-1细胞系；

7、（2）驯化培养：

8、（2.1）sfo-1细胞系经胰蛋白酶-edta消化液消化，制备得到细胞悬液，经传代培养，传代至稳定，得到sfo-2细胞系；

9、其中，上述步骤中，传代培养时选用的培养液为2号培养液；

10、（2.2）sfo-2细胞系经胰蛋白酶-edta消化液消化，制备得到细胞悬液，经传代培养，传代至稳定，得到sfo-3细胞系；

11、其中，上述步骤中，传代培养时选用的培养液为3号培养液；

12、（2.3）sfo-3细胞系经胰蛋白酶-edta消化液消化，制备得到细胞悬液，经传代培养，传代至稳定，得到sfo-4细胞系；

13、其中，上述步骤中，传代培养时选用的培养液为4号培养液；

14、（3）传代培养：

15、sfo-4细胞系经4号培养液进行传代培养，每4-5天传代一次，得到昆虫卵巢组织细胞系-25。

16、作为优选，步骤（1）中，1号培养液是100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、含15％胎牛血清的昆虫细胞培养液。

17、作为优选，步骤（2.1）中，消化步骤为：

18、s01、吸出原培养液，到离心管中；

19、s02、加入1ml 0.25%胰蛋白酶-edta消化液室温消化，3-5min后，去除胰蛋白酶-edta，加入1ml 2号培养液终止消化并吹打细胞，收集细胞悬液，与原培养液一起离心5分钟，离心后上清丢弃；

20、s03、加入新鲜培养基，1：2进行分瓶，置于28℃恒温培养箱开始传代培养，每2-3天更换2号培养液；

21、s04、待汇合度达80-90％时，使用2号培养液进行传代培养，传代至稳定。

22、作为优选，2号培养液是含有100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液。

23、作为优选，步骤s02中，离心转速为1000rpm/min。

24、作为优选，3号培养液为含有100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、含20％新生牛血清的昆虫细胞培养液。

25、作为优选，4号培养液为含有100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、含10％新生牛血清的昆虫细胞培养液。

26、1号培养液、2号培养液、3号培养液、4号培养液中的培养基均还包括基础成份，所述基础成份包括：

27、无机盐：包括氯化钙二水合物、氯化镁六水合物、硫酸镁、氯化钾；

28、氨基酸：包含l-酪氨酸、l-缬氨酸、l-脯氨酸、l-精氨酸盐酸盐、d-果糖（f）-己糖、l-赖氨酸盐酸盐、l-苯丙氨酸、l-苏氨酸、l-丝氨酸；

29、维生素：生物素、氯化胆碱、d-泛酸钙。

30、与现有技术相比，本技术的技术方案所具备的优点或有益效果包括：

31、1、细胞系可连续稳定传代，因此可以大规模生产昆虫卵巢组织细胞系sfo-25，且所用血清价廉，传代后有较好的生长状态，可进行冻存与复苏。

32、2、本发明所驯化的细胞系对十足目虹彩病毒敏感，且病变时间加快，可很好地进行十足目虹彩病毒的体外培养。

33、3、本研究中，通过优化细胞培养工艺，驯化建立的昆虫卵巢组织细胞系sfo-25生长速度加快，培养成本降低。此外，研究分析了该细胞系的特性，进行了对十足目虹彩病毒的敏感性试验，为十足目虹彩病毒的致病机理研究奠定了基础。