流式多指标检测的数字PCR方法与流程

本发明属于数字pcr仪设备设计，具体涉及一种流式多指标检测的数字pcr方法。

背景技术：

1、数字pcr是最新的定量技术，基于单分子pcr方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法，其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至生物芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个，这样经过pcr循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号，根据相对比例和反应器的体积，就可以精准计算出样本中的模板拷贝数。

2、数字pcr技术具有高灵敏度和精准定量的优势，在生命科学和分子诊断领域有巨大的应用前景，但数字pcr技术受限于荧光染料的光谱分布限制，单个pcr反应体系只能同时放置数种荧光探针，仅对应检测数种核酸序列，多指标检测能力不足，难以满足同时区分数十种目标序列的要求。

3、为了提高数字pcr多指标检测能力，一种路线是结合溶解曲线技术，即在检测时控制待测液滴的温度变化，配合荧光探针的序列设计，使得单条或多条荧光探针在不同温度下表现出不同的荧光强度，从而在同样的荧光染料种类下，实现更多指标的检测。但由于检测过程中需要实时改变液滴的温度，已有的技术路线均基于采用成像法数字pcr的平台，即液滴生成后平铺于芯片腔体内，然后在腔体内完成扩增和荧光成像检测。这种办法有一定的局限性，首先成像法进行不同荧光的成像不是同步完成的，因此温度点不能连续变化且每到达一个温度点，需要等待温度平衡后才能依次对不同荧光通道进行成像。受温度控制速度和荧光成像速度限制，往往单个样本需要检测10分钟以上，检测速度慢，通量低。其次，受限于芯片腔体的面积，单个样本的上样体积小且液滴总数较少，导致检测灵敏度受限且核酸定量范围较小。这都限制了该技术在生命科学研究和临床诊断中的应用。也即成像法数字pcr存在如下不足，成像法进行不同荧光的成像不是同步完成的，因此温度点不能连续变化且每到达一个温度点，需要等待温度平衡后才能依次对不同荧光通道进行成像，受温度控制速度和荧光成像速度限制，往往单个样本需要检测10分钟以上，检测速度慢，通量低；受限于芯片腔体的面积，单个样本的上样体积小且液滴总数较少，导致检测灵敏度受限且核酸定量范围较小。

4、而流式荧光检测可同时检测液滴所有荧光通道，且不受成像法平铺限制，检测速度快且上样体积和液滴数不受限制，可克服现有数字pcr结合温度的多指标检测技术中检测速度慢、灵敏度受限和定量范围较小的问题。

5、申请人在先提出的专利申请号为202111381197.4的发明专利公开了一体式数字pcr仪及其控制方法，其具有自动化程度及集成化程度高，能够提升检测分析作业的效率，降低人力成本的技术优势，该技术方案中通过机械手（也即调度机构）调度，将芯片依次在液滴生成模块、翻转模块、pcr扩增模块、检测模块和废料箱之间调度，多张芯片同时工作，形成流水线工作方式，芯片依次完成液滴生成、芯片翻转、液滴扩增、液滴荧光检测这4个数字pcr的环节，该技术方案中采用流式法对样本液滴进行检测时，由于温度循环模块（也即扩增模块）与荧光检测模块分别独立设置，需要调度机构在温度恒定后转移微流控芯片至荧光检测模块处进行检测，这使得其不能实现对样本液滴的连续梯度恒温控制。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种流式多指标检测的数字pcr方法，有效克服现有技术中相关技术中的数字pcr仪中的扩增模块不能实现对样本液滴的连续梯度恒温控制的不足。

2、为了解决上述问题，本发明提供一种流式多指标检测的数字pcr方法，采用数字pcr仪进行，所述数字pcr仪包括液滴生成模块、pcr扩增模块以及荧光检测模块，其中，所述液滴生成模块用于在一体式微液滴芯片内生成微液滴并存储于其具有的反应室内，所述反应室处于所述pcr扩增模块具有的温控腔内；所述数字pcr方法包括如下步骤：

3、将含有待测样本的所述一体式微液滴芯片置于所述数字pcr仪中，并使所述反应室处于所述温控腔内；

4、控制所述液滴生成模块运行以生成微液滴，生成的微液滴存储于所述反应室内；

5、控制所述pcr扩增模块运行以使得所述反应室内的微液滴温度处于预设目标温度上；

6、控制所述荧光检测模块对所述反应室内流出的微液滴进行荧光检测获取流动中的微液滴的荧光信息，并同步记录与获取的所述荧光信息对应的预设目标温度，且保证在荧光检测的过程中，所述反应室皆处于所述温控腔内，所述预设目标温度依据检测规则梯度调整设定。

7、在一些实施方式中，所述数字pcr仪还包括集成模块及旋转机构，所述液滴生成模块及pcr扩增模块皆处于所述集成模块内，所述旋转机构用于驱动所述集成模块上下翻转180°；所述数字pcr方法还包括如下步骤：

8、在所述一体式微液滴芯片置于所述数字pcr仪中时，使所述反应室的底壁朝向上方，并保持于此状态进行微液滴的生成；

9、在微液滴生成完毕后，控制所述旋转机构运行驱动所述集成模块上下翻转180°以使所述反应室的底壁朝向下方。

10、在一些实施方式中，所述集成模块包括第一作业平台及第二作业平台，所述第一作业平台上具有多个用于定位放置所述一体式微液滴芯片的芯片放置凹槽，所述第二作业平台与所述第一作业平台平行设置且具有靠近所述第一作业平台的工作状态以及远离所述第一作业平台的芯片取放状态，所述液滴生成模块及pcr扩增模块处于所述第二作业平台上，当所述第二作业平台处于所述工作状态时，所述液滴生成模块与所述一体式微液滴芯片的芯片油液孔及芯片气液孔分别压紧对接以能够在所述一体式微液滴芯片内形成微液滴，且所述一体式微液滴芯片具有的反应室处于所述pcr扩增模块具有的温控腔内，所述旋转机构用于在所述第二作业平台处于所述工作状态时驱动所述第一作业平台及所述第二作业平台同步翻转180°。

11、在一些实施方式中，所述第一作业平台与所述第二作业平台彼此对应的四角区域各竖直设置有导向滑杆，所述导向滑杆的外周套接有第一复位弹簧，所述第一复位弹簧夹持于所述第一作业平台与所述第二作业平台之间，还包括下压结构，所述下压结构能够在下压力的作用下克服所述第一复位弹簧的弹力使得所述第二作业平台由所述芯片取放状态切换为所述工作状态。

12、在一些实施方式中，所述液滴生成模块包括生成压块，所述生成压块的长度延伸方向与所述第二作业平台的宽度方向平行，且所述生成压块的长度两端经由连接吊耳与所述第二作业平台连接，所述生成压块上形成有生成第一孔及生成第二孔，所述液滴生成模块还包括生成盖板，所述生成盖板具有在生成微液滴时密封所述芯片油液孔及芯片气液孔的顶面并实现所述生成盖板上的气路与所述芯片气液孔的压接连通的盖合位置。

13、在一些实施方式中，所述pcr扩增模块包括半导体加热件，所述半导体加热件的第一端连接有导热块，所述温控腔形成于所述导热块背离所述半导体加热件的端面上，所述半导体加热件的第二端连接有散热结构。

14、在一些实施方式中，所述散热结构包括与所述第二端接触连接的第一散热块以及与所述第一散热块接触连接的第二散热块，所述第二散热块的散热面积大于所述第一散热块的散热面积。

15、在一些实施方式中，所述散热结构还包括第三散热块及导热管，所述导热管的第一端处于所述第一散热块与所述第二散热块之间，所述导热管的第二端与所述第三散热块热交换连接。

16、在一些实施方式中，所述第一散热块与所述半导体加热件的连接位置处环行设置有隔热板；和/或，所述导热块内设置有测温探头及温度保险丝。

17、在一些实施方式中，各所述芯片放置凹槽沿着所述第一作业平台的长度方向依次间隔设置，各所述液滴生成模块及pcr扩增模块皆与各所述芯片放置凹槽一一对应设置。

18、本发明提供的一种流式多指标检测的数字pcr方法，基于流式荧光检测的技术路线，在检测环节，液滴经过荧光检测点时，不同荧光是同步激发和检测的，不需要像成像法那样切换滤光片依次检测，因此可在温度连续变化的情况下检测，避免了温度均衡所需的等待时间和不同荧光通道切换的时间，将检测时间从现有方法中超过10分钟压缩至1分钟，速度提高10倍，显著提高了检测的通量；同时，生成的液滴存储于反应室中，不需要形成单层平铺，因此不受芯片面积的限制，可以上样50微升体系，生成超过10万液滴，相比传统成像法中小于25微升的上样体积和小于3万的液滴总数，显著提高了灵敏度和定量范围；而更为重要的是，本技术中的pcr扩增模块在微液滴流出的过程中始终与反应室紧密环绕包裹，能够保证反应室内的微液滴依据检测规则梯度实时控制调整恒定处于预设目标温度上，极大程度的提高检测通量，提升检测效率。