用于转基因玉米CC-2纯杂合鉴定的引物组及检测方法

本发明涉及生物，具体涉及用于转基因玉米cc-2纯杂合鉴定的引物组及检测方法。

背景技术：

1、全球商业化应用的耐除草剂基因包括耐草甘膦基因epsps(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因)、gat(草甘膦n-乙酰转移酶基因)、goxv247(草甘膦氧化还原酶基因)等，耐草铵膦基因pat和bar(草铵膦乙酰转移酶基因)、耐磺酰脲类除草剂基因als(乙酰乳酸合成酶基因)等。草甘膦是内吸传导型非选择性除草剂，其主要作用靶标为epsps(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)。1983年，孟山都公司及华盛顿大学的研究人员从土壤农杆菌中分离到高度耐受草甘膦的cp4菌株，于1986年成功将其epsps基因插入植物基因组中从而获得耐草甘膦植物。随后，美国、加拿大、阿根廷等5个国家开始商业化种植耐草甘膦大豆、玉米、油菜等。2022年和2023年，国内相继推出了5个耐除草剂转化体，分别是耐啶嘧磺隆/草甘膦玉米‘ncx-1’(转入cdp450和cp4 epsps基因)，耐草甘膦玉米‘ga21’(转入mepsps基因)、抗虫/耐草甘膦玉米‘bt11×ga21’(聚合cry1ab、pat和mepsps基因)、抗虫/耐草甘膦/耐草铵膦玉米‘bt11×mir162×ga2’(聚合cry1ab、pat、vip3aa20和mepsps基因)、抗虫/耐除草剂玉米‘bfl4-2’(转入cry1ab、cry1f和cp4 epsps基因)以及耐草甘膦玉米‘cc-2’(转入maroacc基因)。

2、转基因玉米cc-2是中国农业大学通过基因枪共转化的方法将maroacc基因转入到具有高转化效率的玉米自交系hiiia和hiiib的杂交组合中，用草甘膦进行筛选，获得了500余个maroacc蛋白阳性的转化体，最终通过拷贝数检测及表达量检测等系统筛选获得了一个优良转化体cc-2。在栽培地环境中，转基因玉米cc-2与其对应的非转基因玉米在生育期、株高、产量等方面均一致，可正常生长；在荒地环境中，转基因玉米cc-2及其对应的非转基因玉米与杂草相比不具竞争优势，无杂草化风险(宋新元等.转基因抗除草剂玉米cc-2生存竞争能力研究.作物杂志,2014年06期)。

3、转基因耐除草剂作物商业化将是有效解决我国除草剂使用过程中出现的诸多问题的一种高效新手段，也是提高粮食产业国际竞争力的有效措施。耐除草剂作物的大面积推广，在提高作物产量、节约耕作成本、减少作物要害方面大有益处，同时提高产品竞争力，促进种植结构调整，减少机械作业的碳排放，提高环境生物安全性等方面起到积极作用。

4、已知外源基因在植物体内的表达受到它们染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。目前，针对转基因插入元件检测方法可分为筛查法、基因特异性方法、构建特异性方法和转化体特异性检测方法。转化体特异性pcr检测方法的建立，必须克隆到插入位点的旁侧序列，其中一条pcr引物设计在转化受体基因组上，另一条设计在外源插入片段上。由于确定转化体的插入位点具有唯一性，可以通过转化体特异性pcr检测可以确定转基因植物外源基因插入位置的具体信息。

5、在转基因育种过程中，获得纯合体是一个非常关键的步骤，也是保证种子纯度的重要因素。除了转化体特异性检测，在分子水平上鉴别转基因植株纯杂合也可以通过pcr方法扩增转基因插入位点序列和两端基因组序列。快速、高效地筛选纯合植株，可显著加快转基因育种进程，因此鉴别转基因植株纯杂合方法具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速、准确鉴定转基因玉米cc-2纯杂合的检测方法。

2、第一方面，本发明要求保护引物对组。

3、本发明所要求保护的引物对组由引物对1和引物对2组成；

4、所述引物对1由seq id no.1和seq id no.2所示两条引物组成；

5、所述引物对2由seq id no.3和seq id no.2所示两条引物组成；

6、所述引物对1：seq id no.1和seq id no.2分别设计在插入序列和3’端侧翼序列上，用于特异性检测转基因玉米cc-2；

7、所述引物对2：seq id no.3和seq id no.2分别设计在5’端和3’端侧翼序列上，用于检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合。

8、第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的引物对组在如下中的应用：特异性检测待测玉米是否为转基因玉米cc-2，且检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合。

9、第三方面，本发明要求保护一种既能特异性检测待测玉米是否为转基因玉米cc-2，又能检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合的方法。

10、本发明所要求保护的既能特异性检测待测玉米是否为转基因玉米cc-2，又能检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合的方法，可包括如下步骤：

11、(a1)以待测玉米的基因组dna为模板，采用前文第一方面中的所述引物对1进行pcr扩增；

12、若电泳结果出现368bp的条带，则所述待测玉米为或候选为转基因玉米cc-2，继续进行(a2)检测；反之(无扩增条带)，则所述待测玉米不为或候选不为转基因玉米cc-2，无需再进行(a2)检测；

13、(a2)以经(a1)检测为或候选为转基因玉米cc-2的所述待测玉米的基因组dna为模板，采用前文第一方面中的所述引物对2进行pcr扩增；

14、若电泳结果出现3196bp的条带，则所述待测玉米外源目的基因maroacc的插入为杂合；反之(无扩增条带)，则所述待测玉米中外源目的基因maroacc的插入为纯合。

15、第四方面，本发明要求保护引物对。

16、本发明所要求保护的引物对为引物对1或引物对2；

17、所述引物对1由seq id no.1和seq id no.2所示两条引物组成；

18、所述引物对2由seq id no.3和seq id no.2所示两条引物组成；

19、所述引物对1用于特异性检测转基因玉米cc-2；所述引物对2用于检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合。

20、第五方面，本发明要求保护前文第四方面中所述的引物对的如下任一应用：

21、(b1)前文第四方面中所述引物对1在特异性检测转基因玉米cc-2中的应用；

22、(b2)前文第四方面中所述引物对2在检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合中的应用。

23、第六方面，本发明要求保护如下任一方法：

24、方法i：一种特异性检测待测玉米是否为转基因玉米cc-2的方法，可包括如下步骤：以待测玉米的基因组dna为模板，采用前文第四方面中的所述引物对1进行pcr扩增；

25、若电泳结果出现368bp的条带，则所述待测玉米为或候选为转基因玉米cc-2，反之(无扩增条带)，则所述待测玉米不为或候选不为转基因玉米cc-2。

26、方法ii：一种检测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入是杂合还是纯合的方法，可包括如下步骤：以待测转基因玉米cc-2的基因组dna为模板，采用前文第四方面中的所述引物对2进行pcr扩增；

27、若电泳结果出现3196bp的条带，则所述待测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入为杂合；反之(无扩增条带)，则所述待测转基因玉米cc-2中外源目的基因maroacc的插入为纯合。

28、在上述各相关方面中，所述待测玉米可为转基因玉米cc-2的有性杂交后代或自交后代。

29、在上述各相关方面中，进行所述pcr扩增时的反应条件为如下任一：

30、(1)95℃预变性3min；以95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s为1个循环，共进行32个循环；72℃终延伸5min。

31、(2)95℃预变性3min；以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min 15s为1个循环，共进行32个循环；72℃终延伸5min。

32、其中，所述引物对1优选适用(1)中所示反应条件；所述引物对2优选适用(2)中所示反应条件。

33、在上述各相关方面中，进行所述pcr扩增时的反应体系(25μl)中上下游引物的终浓度均为0.4μm，dna模板的量小于0.25μg/25μl。

34、第七方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的引物对组或前文第四方面中所述的引物对或前文第二方面或前文第三方面中所述的方法在如下中的应用：在转基因玉米cc-2的有性杂交后代或自交后代中筛选外源目的基因maroacc的插入为纯合的株系。

35、第八方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的引物对组或前文第四方面中所述的引物对或前文第二方面或前文第三方面中所述的方法在如下中的应用：提高耐除草剂转基因玉米制种过程中种子纯度和/或种子质量。

36、在本发明中，两个染色体组均发生maroacc基因插入的转基因玉米cc-2为纯合，仅一个染色体组发生maroacc基因插入的转基因玉米cc-2为杂合。其中，所述maroacc基因的载体信息如图1所示。

37、本发明针对转基因玉米cc-2，设计了包含于侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物，并在此基础上，进一步引入插入位点两端侧翼序列的第三引物和第四引物，建立了一套转基因玉米cc-2纯杂合的pcr检测方法，本发明对于育种过程中筛选纯合转化体，提高种子纯度及质量具有重要意义。

38、本发明转基因玉米cc-2对草甘膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，通过对其有性杂交后代插入位点纯、杂合的鉴定，能够有效提高制种过程中的种子纯度及种子质量，还将有助于遵守相关法规，保障国家粮食安全。