磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶A5L6、其编码基因、含有该基因的重组载体和重组菌的应用

本发明属于基因工程，具体涉及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6、其编码基因、含有该基因的重组载体和重组菌的应用。

背景技术：

1、聚酮类化合物是天然产物中的一大类，其来源广泛、种类繁多，结构多样，具有丰富的生物活性，是临床药物和绿色天然产物农药创制的重要来源。链霉菌是聚酮类天然产物农药的主要工业生产菌。然而，链霉菌代谢调控网络复杂，仍有若干影响聚酮等天然产物生物合成的关键作用机制尚未被彻底解析，导致高产菌开发缓慢，发酵工业面临产物得率低、生产成本高等共性问题，严重阻碍了聚酮类化合物的开发与应用，是聚酮类天然产物研究领域一个亟待解决的问题。

2、酰基载体蛋白（acyl-carrier protein，acp）是聚酮合酶（polyketide synthase,pks）发挥作用的必需结构单元，在作用于底物的酶之间进行链的传递。acp发挥作用，需要由无活性的脱辅基形式（ apo-）转变为活性的全蛋白形式（ holo-），磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheinyl transferase，pptase）是催化该反应的酶，其将辅酶a的磷酸泛酰巯基乙胺基转移臂（ppant）转移到acp的丝氨酸残基上，完成acp的活化。因此，pptase是pks发挥作用的关键酶，也是聚酮、非核糖体肽等天然产物生物合成的关键酶。

3、目前，pptase作为重要的催化元件，可用于菌株改造的高效pptase鲜有研究，造成了催化元件匮乏，用于天然产物高效合成的pptase元件选择单一。因此，挖掘高效率的pptase对于提高聚酮、非核糖体肽等天然产物产量具有重要价值。

技术实现思路

1、为了提高聚酮、非核糖体肽等天然产物产量，本发明利用生物信息学分析等手段从数据库中挖掘到一个高效pptase a5l6（uniprot蛋白登录号为a0a6g3a5l6），通过构建含有该酶编码基因的重组载体和重组菌，发现过表达该酶可以有效提高聚酮、聚醚、非核糖体肽等天然产物产量。

2、为解决上述技术问题并实现相应技术效果，本发明提供了如下技术方案：

3、本发明的第一个目的是提供一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6在促进天然产物合成中的应用，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述天然产物为聚酮类化合物、聚醚类化合物或非核糖体肽类化合物。

4、本发明的第二个目的是提供磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6的编码基因在促进天然产物合成中的应用，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述天然产物为聚酮类化合物、聚醚类化合物或非核糖体肽类化合物。

5、本发明的第三个目的是提供一种含有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6编码基因的重组载体在促进天然产物合成中的应用，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述天然产物为聚酮类化合物、聚醚类化合物或非核糖体肽类化合物。

6、在本发明的一种实施方式中，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：构建含有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6编码基因的重组表达载体pset28a-a5l6，利用xbai和ecori两个限制性内切酶对携带组成型启动子perme*的质粒pset152-perme*进行双酶切，获得线性载体骨架lpset152-1；以pset28a-a5l6为模板扩增 a5l6基因片段，利用gibson组装法将带有同源臂的 a5l6基因片段与线性载体骨架lpset152-1进行组装，得到重组载体pset152-perme*-a5l6。

7、在本发明的一种实施方式中，所述扩增 a5l6基因片段采用的引物为核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物a5l6-f和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物a5l6-r。

8、本发明的第四个目的是提供一种含有上述编码基因或上述重组载体的重组菌在促进天然产物合成中的应用，所述天然产物为聚酮类化合物、聚醚类化合物或非核糖体肽类化合物。

9、在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法包括如下步骤：构建磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶a5l6编码基因过表达整合质粒，将过表达整合质粒转化进大肠杆菌中，再通过属间接合转移实验将过表达整合质粒导入出发菌株中获得重组菌。

10、在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为et12567(puz8002)。

11、在本发明的一种实施方式中，所述出发菌株为冰城链霉菌（ streptomyces  bingchenggensis）bc-101-4，天蓝色链霉菌（ streptomyces coelicolor）m145，阿维链霉菌（ streptomyces avermitilis）s0，龟裂链霉菌（ streptomyces rimosus）m4018，刺糖多孢菌（ saccharopolyspora spinosa）nrrl 18395，玫瑰孢链霉菌（ streptomyces roseosporus）nrrl 11379，委内瑞拉链霉菌（ streptomyces venezuelae）isp5230或白色链霉菌（ streptomyces albus）ippdnr。

12、在本发明的一种实施方式中，当出发菌株为冰城链霉菌bc-101-4时，重组菌用于提高米尔贝霉素或南昌霉素的产量；当出发菌株为天蓝色链霉菌m145时，重组菌用于提高放线紫红素的产量；当出发菌株为阿维链霉菌s0时，重组菌用于提高阿维菌素的产量；当出发菌株为龟裂链霉菌m4018时，重组菌用于提高土霉素的产量；当出发菌株为刺糖多孢菌nrrl 18395时，重组菌用于提高多杀菌素的产量；当出发菌株为玫瑰孢链霉菌nrrl 11379时，重组菌用于提高达托霉素的产量；当出发菌株为委内瑞拉链霉菌isp5230时，重组菌用于提高杰多霉素的产量；当出发菌株为白色链霉菌ippdnr时，重组菌用于提高柔红霉素的产量。

13、本发明的有益效果：

14、本发明利用生物信息学分析等手段从数据库中挖掘到一个高效pptase a5l6，通过构建含有该酶编码基因的重组载体和重组菌，共获得8株搭载高效pptase元件a5l6的高产重组菌株。获得的重组菌株天蓝色链霉菌m145-a5l6的放线紫红素产量相比于出发菌株m145提高了111.60%，达到261.89 mg/l；重组菌株冰城链霉菌bc-101-4-a5l6的米尔贝霉素产量相比于出发菌株bc-101-4提高了53.48%，达到1496.79 mg/l，同时南昌霉素的产量相比于出发菌株bc-101-4提高了167.15%，达到3121.90 mg/l；重组菌株阿维链霉菌s0-a5l6的阿维菌素产量相比于出发菌株s0提高了34.54%，达到2.86 g/l；重组菌株刺糖多孢菌nrrl 18395-a5l6的多杀菌素产量相比于出发菌株nrrl 18395提高了79.33%，达到48.78mg/l；重组菌株龟裂链霉菌m4018-a5l6的土霉素产量相比于出发菌株m4018提高了34.6%，达到1.57 g/l；重组菌株玫瑰孢链霉菌nrrl 11379-a5l6的达托霉素产量相比于出发菌株nrrl 11379提高了79.24%，达到405.89 mg/l；重组菌株委内瑞拉链霉菌isp5230-a5l6的杰多霉素产量相比于出发菌株isp5230提高了69.60%，达到408.61 μg/ml；重组菌株白色链霉菌ippdnr-a5l6的柔红霉素产量相比于出发菌株ippdnr提高了62.98%，达到43.19 μg/ml。上述结果说明挖掘到的pptase元件a5l6可以有效提高聚酮合酶和非核糖体肽合成酶的催化效率，进而提高ⅰ、ⅱ型聚酮类化合物、聚醚类化合物及非核糖体肽类化合物的产量。