一种基于巢氏MIRA检测布鲁氏菌的引物探针组合、方法及其应用与流程

本发明涉及布鲁氏菌检测，尤其是涉及一种基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合、方法及其应用。

背景技术：

1、布鲁氏菌病（简称布病）是由革兰氏阴性菌——布鲁氏菌（brucella）引起的一种人畜共患病，主要损害生殖系统和关节，导致畜牧业的重大经济损失和人类的严重健康问题。在中国，该病主要通过牛、羊、猪三种牲畜传播，其中羊种布鲁氏菌对人体的传播性最强，致病率最高。

2、布鲁氏菌通过复杂的机制逃避人体免疫系统：经由皮肤伤口或黏膜进入人体后，布鲁氏菌首先被免疫细胞吞噬，然而，作为一种胞内寄生菌，布鲁氏菌能够在吞噬细胞内生存和繁殖，有效地躲避体液免疫和其他抗菌因子的攻击。这种胞内增殖最终导致吞噬细胞裂解，将布鲁氏菌释放到淋巴和血液循环中，引起菌血症。随后，细菌在肝、脾、骨髓等器官中建立多个感染灶。随着感染加重，布鲁氏菌可以在血流中进行胞外繁殖，导致败血症和间歇性发热。布鲁氏菌的裂解也会释放内毒素，进一步加剧组织损伤和疾病进程。如果免疫系统受损或感染严重，布鲁氏菌可以逃避免疫清除，导致慢性感染和反复发作，并伴随多种临床表现，对畜牧业和人类健康构成重大威胁。

3、目前，布鲁氏菌病的诊断方法主要包括血清学检测、微生物培养和分子检测。血清学检测，如虎红平板凝集试验（sat）、酶联免疫吸附试验（elisa）和玫瑰红试验（rbpt），容易出现交叉反应和假阳性。微生物培养虽然被认为是金标准，但耗时长、劳动强度大、存在实验室人员感染风险，并且灵敏度低、判读结果具有主观性。

4、分子检测方法，包括定量pcr（qpcr）、数字pcr（dpcr）和等温扩增技术，如rpa、lamp，可快速、灵敏、特异地检测布鲁氏菌dna。目前，已有一些基于pcr和等温扩增技术的布鲁氏菌检测方法被报道。例如，专利cn 117867145 a公开了一种基于qpcr的检测方法，专利cn 108220461 a描述了一种针对羊布鲁氏菌的rpa方法。然而，这些方法仍然存在一些局限性，例如qpcr需要昂贵的仪器和专业人员操作，而常规的等温扩增方法灵敏度相对较低。

5、多酶恒温快速扩增（multienzyme isothermal rapid amplification，mira）是一种新型的等温扩增技术，它使用了一种来源于天蓝色链霉菌的reca重组酶（sc reca）。与rpa（t4 uvsx）和raa（大肠杆菌 uvsx）不同，mira具有更高的稳定性和抗抑制剂能力。mira可在37-42°c的恒温条件下进行，其结果可通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光或侧向流层析试纸条进行判读。

6、尽管mira技术具有简便、快速、高特异性的优势，使其非常适合现场检测，但目前尚未见其应用于布鲁氏菌检测的报道。此外，据文献报道，mira的灵敏度通常低于qpcr，限制了其在低浓度样本中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合、方法及其应用，以解决目前布鲁氏菌的检测容易出现交叉反应和假阳性，耗时长、劳动强度大、存在感染风险、主观性强、灵敏度低，对仪器设备和人员专业度要求高的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供一种基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合，所述引物探针组合包括：内围上游引物bru-1if、内围下游引物bru-3ir、外围上游引物bru-2of、外围下游引物bru-2or和探针。

3、优选的，内围上游引物bru-1if的序列如seq id no.1所示，内围下游引物bru-3ir的序列如seq id no.6所示，外围上游引物bru-2of的序列如seq id no.8所示，外围下游引物bru-2or的序列如seq id no.11所示。

4、优选的，探针序列自5′端起第29位碱基t标记fam荧光报告基团、第31位碱基t被四氢呋喃thf取代、第33位碱基t标记bhq-1荧光淬灭基团，3′端进行c3spacer阻断修饰，序列如seq id no.13所示。

5、一种基于巢氏mira检测布鲁氏菌的方法，利用上述基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合，以提取的待测样本的dna为模板，配置一步反应体系，混匀后于38-42℃恒温反应10分钟，以反应产物为模板配置二步反应体系，混匀后于38-42℃恒温反应20分钟，可以采集到荧光信号即为阳性。

6、优选的，一步反应体系包括如下组分：a缓冲液29.4μl、外围上游引物2μl、外围下游引物2μl、ddh2o 9.1μl、模板5μl、b缓冲液2.5μl、mira反应酶；引物的浓度均为10μm，a缓冲液、b缓冲液和mira反应酶均取自dna恒温快速扩增试剂盒-荧光型。

7、优选的，二步反应体系包括如下组分：a缓冲液29.4μl、内围上游引物2μl、内围下游引物2μl、探针0.6μl、ddh2o 8.5μl、模板5μl、b缓冲液2.5μl；探针和引物的浓度均为10μm，a缓冲液和b缓冲液均取自dna恒温快速扩增试剂盒-荧光型；模板为一步反应产物。

8、一种布鲁氏菌检测试剂盒，包括上述基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合。

9、一种如上所述的基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合在布鲁氏菌检测中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

10、一种如上所述的恒温扩增快速检测布鲁氏菌的方法在布鲁氏菌检测中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

11、本发明创造性地开发了一种新型巢氏mira（nestmira）检测方法，用于快速、高灵敏地检测布鲁氏菌。nestmira技术不仅保留了mira原有的操作简便、无需复杂设备的优点，更通过巢式扩增策略显著提高了检测灵敏度，使其能够媲美甚至超越qpcr。更重要的是，nestmira的整个反应流程可以在便携式恒温设备上完成，检测结果可通过肉眼观察或简易设备读取，使其成为疫区家畜（牛、羊）及人群布鲁氏菌现场筛查的理想工具。这一创新将极大推动布鲁氏菌病的快速诊断和及时管理，为改善动物和人类健康提供有力支持。

12、因此，本发明提供的一种基于巢氏mira检测布鲁氏菌的引物探针组合、方法及其应用，其具体技术效果如下：

13、（1）本发明提供的布鲁氏菌检测方法，相较于sat、rbpt血清学检测方法，具有特异性强，无交叉反应的优势；相较于血培养、qpcr技术，具有检测时间短、操作便捷的优势，可在30分钟内完成巢氏mira扩增并检测；

14、（2）本发明提供的布鲁氏菌检测方法，检测性能得到大幅度提升，相较于普通mira，检测下限提高了10倍，可达到1.73copies/μl；

15、（3）社会价值高，本发明基于巢氏mira技术，符合poct（point-of care testing，即快速、灵敏、特异、设备要求低和经济实惠）的要求，可以克服设备依赖的限制，是疫区家畜（牛、羊）及人群布鲁氏菌现场筛查的理想工具，为布鲁氏菌早筛、早诊及防治畜间传播、人畜间传播提供有力的诊断工具。