一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和生物技术领域。具体涉及一种油菜抗菌肽BnCRPl及其应 用。
【背景技术】
[0002] 病原菌可引起包括人类，牲畜，作物和其他生物的严重病害，造成严重的经 济损失。植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80%以上的植物病害（张福丽， 王占斌，王志英.几丁质酶在植物抗真菌病害中的作用.林业科技.2006,31 (3): 24-27)，造成世界粮食作物减产约 20 % (Knight S.C·，Anthony V.M·，Brady A.M.，et al. Rationale and perspectives on the developmentof fungicides. Annu Rev Phytopathol，1997,35:349-372)。许多重要植物病害都是真菌造成的，如马铃薯晚疫病、 稻瘟病、小麦白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成非常巨大 的经济损失。另一方面，真菌在侵染植物的过程中，释放出来的代谢产物一一真菌毒素 (mycotoxin)，对农作物以及人类的健康也造成极大的危害，如黄曲霉毒素（aflatoxin) 等。
[0003] 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘 菌科、核盘菌属。是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盘菌可以广 泛地侵染很多单子叶和双子叶植物。核盘菌引起的菌核病是一种类似于灰霉的腐生营 养型真菌，这种破坏性病源侵染超过400种植物，分布广泛。目前对菌核病的防治主要 依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想；同时，食品的安 全性也受到严重影响。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，茎和角 果的腐烂，导致了巨大的产量损失。尽管菌核病严重威胁了农业生产，植物对核盘菌的 寄主抗性的分子机制，我们依然知之甚少。暨今为止还没有发现完全免疫或者高抗的油 菜栽培品种（Liu, S.，Wang, H.，Zhang, J.，Fitt, B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang, W. ,and Guo, X. 2005. In vitro mutation and selection of doubled-hapIoid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24:133-144)，因此，探宄植物对这种病源的抗性机制，发现新的抗性基因具有深远意 义。
[0004]目前常用的病害防治措施，主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环 境，而且防效也不理想；同时，食品的安全性也会受到严重影响。随着社会的进步，人们越来 越深刻地认识到长期大量使用化学农药对生态环境和人类健康的危害。生物防治可以有效 地克服这些弊端，因而生物农药越来越受到人们的重视。
[0005] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有抗菌活性的天然小分子 蛋白，广泛存在于生物界，是机体非特异性免疫的重要组成部分，在体内体外均具有抗菌 活性(Gordon YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res. 2005, 30(7):505 - 515)。抗菌肽的广泛的生物学活性，对细菌真菌、原生动物、病毒和肿瘤等有很强的抑制作 用，具有高效、环保、不使病原菌产生耐药性等优点使它在生物防治和医学上具有良好的应 用前景（Gordon YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。近年来已经成为植物抗病基因工程、养殖饲料添加剂，食品防腐剂、新兴医药等领域的 研宄热点，在疾病防治领域中是抗生素的理想替代品（Boman HG，Peptide antibiotics and their role in innateimmunity. Annu Rev Immunol. 1995,13 :61-92) 〇 在农业生产过程 中，用抗菌肽进行植保工作可以避免农用抗生素通过食物链的传递对人体产生的威胁。
[0006] 按照氨基酸序列及二级结构，已发现的植物抗菌肽可以分为植物防御素 (plant defens ins)、车专月旨蛋白(lipidtransfer proteins，LTPs)，硫素（thionins)，蜕 皮素（snakins)，橡胶蛋白类（hevein-like)，打结素类（knottin-like peptides)，凤 仙花素（IbAMP)，和新近发现的养菜素（shepherdins)、环肽（cyclotides)等（Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother, 1999,43 (6)： 1317-1323)。抗菌肽基本上都具有一些共性，如：小分子量（〈lOKDa)，阳离子表面、正电荷 以及两亲性，这些特性使得抗菌肽能够和细胞膜绑定并能够插入到细胞内部，大部分抗菌 肽是通过破坏细胞膜从而使目标细胞死亡而达到杀菌目的。而另一些抗菌肽却能够通过细 胞膜上的离子通道进入到细胞内部破坏细胞而不破坏细胞膜（Vogel PMHaHJ:Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochem Cell Biol 1998, 76:235-246.)。大多数类型的植物源抗菌肽对动物和植物细胞都没有毒性（Murad AM. Pelegrini PB. Neto SM. Novel Findings of Defensins and their Utilization in Construction of Transgenic Plants. Transgenic Plant Journal 2001 (I):39-48)〇 与 动物源抗菌肽相比，植物源抗菌肽更易于在作物中表达和调控，不容易被细胞内的蛋白酶 降解。与其他杀菌剂相比，植物来源的抗菌肽对环境的影响更小，更友好，更具开发成为抗 真菌生物制剂的潜力（Hancock REW, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother，1999,43 (6) :1317-1323)。如将Rs-AFPs等植物抗菌肽基因导入微生物中进行 发酵，更容易克服对宿主的毒性作用而进行大量生产。
[0007] 抗菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的小分子肽，它能被细 菌、真菌或物理的、化学的刺激所诱导，甚至有些抗菌肽在植物体内能形成组成性的表达。 它不仅能抗多种细菌，而且可以抑杀真菌、病毒等，可用于转化农作物、培养抗病品种，因 而在植物育种基因工程领域中具有广阔的应用前景。首先在模式植物烟草与马铃薯抗青枯 病研宄中获得成功，随后在水稻白叶枯病菌和细条病菌苹果的梨火疫病，菊花、辣椒、茄子 等作物的细菌、真菌病研宄中均取得了一定效果。将萝卜抗菌肽基因（AFP)转基因到马铃 薯中可获得晚疫病抗性等（任玉霞，陈凌娜，陈继峰，陈正华，马铃薯转萝卜抗菌肽基因 植株的获得及抗晚疫病的初步鉴定，中国蔬菜2012 ￠) :68-73)。
[0008] 植物源抗菌肽都有广谱抗真菌或细菌活性，在一种植物中发现的抗菌肽可以有效 的应用到其他多种植物中，如萝卜中来源的抗菌肽能够通过转基因的方法转到野罂粟、马 铃薯和小麦中分别达到抗马铃薯晚疫病和小麦镰刀菌的效果（魏玉杰，张梅秀，常瑛， 雒淑珍，陈凌娜，野罂粟花粉介导法转萝卜抗菌肽基因方法研宄，甘肃农业科技2009(11): 6-9;任玉霞，陈凌娜，陈继峰，陈正华，马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及抗晚疫病的 初步鉴定，中国蔬菜 2012(6) :68-73 ;Zhao Li，Miaoping Zhou，Zengyan，ZhangLi，juan Ren，LipuDu，Boqiao Zhang，Huijun Xu，Zhiyong Xin，Expression of a radish defensin in transgenic wheat confers increased resistance to Fusarium graminearum and Rhizoctonia cerealis Funct Integr Genomics 2011，11:63 - 70) D 抗菌肽作为新兴抗病 基因资源，对改良水稻、大豆、棉花、油菜等作物对真菌病害的抗性有着重要意义。
[0009] 抗菌肽因其独特的抗菌机理，广谱的抗菌性以及不易产生耐药性等特点，在各行 各业中都有良好的应用前景，因此也已经受到越来多的关注，成为前沿领域的研究热点 (Hancock REWj Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother，1999， 43(6) :1317-1323)。但是，目前植物来源的抗菌肽还很难真正应用到农业生产实践中。主 要是因为目前鉴定的有功能的植物来源抗菌肽数量很少，从而在很大程度上限制了植物抗 菌肽的应用。抗菌肽数据库中经过验证的抗菌肽基因目前达到1600多个，而植物抗菌肽仅 有不到300个（http://ercbinfol. ucd. ie/APFDb/)。被鉴定的植物来源抗菌肽基因数量少 的主要原因如下：1、抗菌肽基因相对比较小，容易降解，且含量低，难以检测和鉴定；2、抗 菌肽分子量小，分离纯化困难，提取步骤烦琐、得率低；3、体外表达纯化困难，导致难以开展 体外抑菌活性检测来验证功能；4、缺乏高效的预测筛选方法；5、抗菌肽化学合成成本高， 价格昂贵。如何高效的预测具有功能的新植物抗菌肽，实现其水平表达并降低成本成为目 前抗菌肽研究与应用的瓶颈。
[0010]由本发明申请人中国农业科学院油料作物研究所负责、中国农科院蔬菜 所、深圳华大基因研究院、华中农业大学、湖南大学、西南农业大学、江苏农科院、四 川农科院、青海大学，并吸收英、澳、美、法等国相关研究机构科研人员合作完成了甘 蓝和油菜的全基因组测序和分析，甘蓝和油菜基因组部分结果论文已发表（Shengyi Liu j Yumei Liuj Xinhua Yang, Chaobo Tong, David Edwards, Isobel A. P. Parkin, Meixia Zhao,Jianxin Ma，Jingyin Yu，Shunmou Huang, Xiyin Wang, Junyi Wang, Kun Lu, Zhiyuan Fang,Ian Bancroft, Tae-Jin Yang, Qiong Huj XinfaWangj Zhen Yue，Haojie Li, Linfeng Yang,Jian Wuj Qing Zhou,Wanxin Wang, Graham J.King,J.Chris Piresj Changxin Lu, ZhangyanWuj Perumal Sampathj ZhuoWangj Hui Guo,Shengkai Pan, Limei Yang, Jiumeng Min，Dong Zhang, Dianchuan Jinj Wanshun Li,Harry Belcramj Jinxing Tuj Mei Guanj Cunkou Qil8,Dezhi Dulj Jiana Li, Liangcai Jiang, Jacqueline Batleyj Andrew G.Sharpe,Beom-Seok Park, Pradeep Ruperaoj Feng Cheng, Nomar Espinosa Waminal Yin Huang,Caihua Dong, LiWangj Jingping Li, Zhiyong Huj Mu Zhuangj Yi Huang, Junyan Huang, Jiaqin Shi，Desheng Meij Jing Liuj Tae-Ho Lee, Jinpeng Wang, Huizhe Jinj Zaiyun Li, Xun Li, Jiefu Zhang, Lu Xiao, Yongming Zhou, Zhongsong Liu，Xuequn Liuj Rui QinjXu TangjWenbin LiujYupengWangjYangyong ZhangjJonghoon LeejHyun Hee Kim，France Denoeudj Xun Xu，Xinming Liang, Wei Huaj Xiaowu Wang, Jun Wang, Boulos Chalhoub&Andrew H.Paterson. The Brassica oleracea genome reveals the as