一种通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种募集间充质干细胞的方法，具体涉及一种通过建立大鼠应力骨折 模型募集间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 在组织器官损伤修复、组织工程和疾病治疗领域，尽管胚胎干细胞等呼声很热，但 是最理想的细胞依然是自体组织细胞。因此如何获得和利用自体组织、自体干细胞一直是 研究人员关注的问题。
[0003] 现在，干细胞的来源和应用理论大体分为3个重要方向，第一，胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ES);第二，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC);第三，利 用基因重编程（reprogramming)改造体细胞培育诱导性多能干细胞（induced pluripotent stemcell，iPS)。目前ES的研究由于受伦理学争议、免疫排斥、实验技术限制等影响，阻碍 了其研究和在临床治疗中的应用。间充质干细胞因可以实现自体干细胞移植，而且具有体 内迁移与增殖分化并参与修复过程的特性，而在近年成为研究热点。目前，多采用消化法分 离骨折断端组织中的间充质干细胞，这种方法需要多种酶的参与，操作时间长，而且酶的使 用会降低细胞的活力、减少细胞数目。
[0004] 在骨科临床中，应用自体间充质干细胞(MSC)移植治疗股骨头坏死和骨不连等疾 病取得了一定的疗效。在骨折治疗中，随着生物学内固定理念的创新和新技术的应用，认 识到了保护血运、建立稳定性和骨折对位三者平衡对建立骨折愈合优良生物力学与生物学 环境的重要性。骨折愈合需适当的生物力学环境和最佳应力水平，大量研究表明，在骨折 愈合早期，微动能够促进骨折愈合：①适当的微动可促进骨折区毛细血管形成和PGE2的释 放，PGE2具有较强的诱导成骨作用，可加速未分化的间充质干细胞在有氧条件下不断分化 为成骨细胞和成软骨细胞，进一步促进骨折愈合；②骨细胞可以感受机械应力的刺激，骨细 胞、成骨细胞等代谢活性增加；③前列腺素合成增加，促进骨细胞增殖；④延长骨折修复的 炎症期，炎症期细胞及毛细血管均较旺盛，释放许多生化介质、骨生成因子等，使局部组织 细胞释放成骨活性物质的能力恢复，从而诱导局部间充质干细胞增殖，分化为成骨细胞或 成软骨细胞；⑤微动引起的生物反应参与了启动新骨形成的细胞募集和分化，所以骨折愈 合早期为力学因素促进骨折愈合的最有效时期。但是关于微动促进骨折愈合的细胞学机制 仍不十分清楚，如果阐明了微动与细胞分子活动之间的关系，将有可能通过控制力学环境 来促进骨折愈合，对其深入研究，最终实现骨折病人量化控制康复过程，使康复过程引起的 微动始终处于有利骨折愈合的安全范围，才能有效避免盲目康复引起的各种骨折并发症， 实现骨折治疗目标。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种符合临床特点的，操作简单、 科学合理的通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，通过控制固定骨折处的力学 环境，可以募集较多数量的间充质干细胞参与骨折愈合的过程。有研究表明，在骨折初期， 骨折局部只有少量的成骨细胞和成软骨细胞，如果仅依靠此时成骨细胞的数量，换算股骨 干骨折愈合时间需要200-1000年。实际上，被骨折创伤激活的各种细胞在骨折愈合不同阶 段会产生各种相应的生物活性物质，极大地加速了骨折愈合过程。首先是间充质干细胞的 增殖和分化，这是骨折愈合的前提和关键。因此增加骨折局部间充质干细胞的数量成为促 进骨折愈合的重要基础。本发明方法通过控制力学环境募集更多的间充质干细胞，间充质 干细胞增殖和分化，使成骨细胞和成软骨细胞数量剧增，有效促进骨折愈合。本发明对指导 骨折治疗和量化控制骨折康复过程有重要的临床意义。首先明确了骨折愈合早期是募集间 充质干细胞的关键时期，此时也是预防关节粘连的关键时期，因此，肢体康复宜早期进行而 且需要有限量的康复。肢体康复活动的应力既能使骨折断端募集间充质干细胞，又能防止 肢体肌肉萎缩和关节粘连。肢体康复活动是治疗骨折的重要措施，决定骨折治疗的最终效 果。但功能康复引起的微动必须始终处于有利骨折愈合的安全范围，本发明方法能够帮助 确定肢体康复的安全范围，从而实现骨折病人量化控制康复过程，实现骨折治疗目标。
[0006] 本发明技术方案理论依据：骨折愈合需要足够量的间充质干细胞(MSC)的参入， 而在骨折初期，骨折局部只有少量的间充质干细胞、成骨细胞和成软骨细胞，间充质干细胞 的增殖和分化，这是骨折愈合的前提和关键。因此增加骨折局部间充质干细胞的数量成为 促进骨折愈合的重要基础。干细胞具有对组织损伤产生反应，可迁徙、增殖分化并参入修复 过程。因此，骨折愈合早期是促进骨折愈合的关键时期，在骨折愈合早期，骨折断端在骨创 伤和适度应力刺激的共同作用下，骨髓内的间充质干细胞(MSC)、周围肌肉和血液的成体干 细胞，就会通过相应的途径向骨折处迁徙，这样骨折局部可以募集较多数量的干细胞。本发 明采用适宜固定应力的外固定架，建立了大鼠股骨干骨折断端微动模型，即大鼠应力骨折 模型，采用剪切法分离骨折断端组织中的细胞，简便易行，对细胞损伤很小。
[0007] 本发明技术方案为：首先建立外固定支架固定的大鼠应力骨折模型，造模成功 后，在不同时点，取出骨折断端组织，分离间充质干细胞并进行培养，用于研究骨折愈合早 期应力环境对骨折断端间充质干细胞募集的影响，及对间充质干细胞分化的进一步研究。
[0008] 所述的外固定支架包括4枚钢针和2块横梁，4枚钢针呈梳齿状均匀排布在两块横 梁之间，2块横梁由2枚钛合金微型螺钉固定在一起；外固定支架轴向固定应力为4. 5N/mm。
[0009] 所述的钢针选用意大利Orphfix产品。钢针的股骨接触端直径为0. 8mm，另一端直 径为1. 2_ ;所述的横梁，材料为高分子聚乙烯医用材料，其刚度、弹性、韧性均符合生物力 学要求，且具有不遮挡x光线的特性和牢固固定钢针的独特优势；所述的钛合金微型螺钉 直径为2. 6mm;所述的外固定支架长、宽、高分别为20mm、5. 5mm、6mm。
[0010] 1本发明一种通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，步骤为： 1)建立大鼠应力骨折模型 大鼠称重后，3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，手术侧股骨去毛备皮，消毒铺巾， 手术在严格无菌条件下进行，从股骨外侧切口，自外侧肌间隙暴露股骨，首先放置外固定支 架，外固定支架自股骨小粗隆至股骨髁上跨越股骨全长，固定完成后，在内侧2个固定钢针 之间用厚度1mm的微锯横行切断股骨，冲洗刀口，用可吸收线缝合肌肉组织，用不可吸收 线缝合皮肤，手术后3天将大鼠的饮用水中加入12mg/500ml的镇痛药盐酸曲马多，手术前 30min及手术后3天皮下注射45mg/kg的克林霉素，防止细菌感染；手术完成后，大鼠自由 活动，每天钢钉处常规消毒； 2)细胞的分离及原代培养 按步骤1)方法建立大鼠应力骨折模型，分别于造模后第6、9、12、15、18天时，处死大 鼠，取出骨折断端组织和健侧股骨，按照下面方法分离细胞：取出的骨折断端组织用磷酸缓 冲盐溶液（PBS)漂洗2次，剪切至糊状；用培养基反复轻轻吹打，使之穿过200目筛网，收 集迁移细胞（migratingcells，MCS)悬液，收集未滤过的材料，重复用培养基重悬，过滤，收 集合并迁移细胞悬液，离心后用培养基重悬细胞；按照以下的方法分离大鼠的骨髓细胞， PBS液冲出骨髓，收集骨髓细胞悬液，调整细胞浓度至106/ml，按体积比1 : 1加入Ficoll 分离液，1800r/min离心20min，吸取界面单个核细胞，用PBS洗2次，用培养基重悬细胞， 将分离的骨髓细胞、迁移细胞浓度调整到IX106/ml，接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶中， 移入37°C、5%C02的培养箱中培养；3天后全量更换新培养液，去除未贴壁细胞，细胞密度达 80%?90%，即进行传代。
[0011] 所述的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基。
[0012] 2观察及评价方法 1)骨折断端组织细胞计数：分别于造模后第6、9、12、15、18天时，处死大鼠，取出骨折 断端组织和健侧股骨，用D-Hanks液漂洗，剪切材料加入等量的DMEM培养基，台盼蓝染色， 细胞计数。
[0013] 2)形态学观察：在倒置显微镜（Olympus公司）下每日观察细胞的形态学特征。
[0014] 3)细胞增殖曲线分析：将骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以2X105cells/ml/ 孔接种在24孔板内，每隔24h消化3个孔，收集细胞，并用0. 4%的台盼蓝计数活细胞，绘制 生长曲线。并按下式计算细胞倍增时间：TD=tX[lgZ/GgNt-lgNd)]。Nt:收集细胞数；％: 接种细胞数；t:培养时间。
[0015] 4)细胞的诱导分化 成骨诱导分化：取骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以105/孔的密度接种于6-fL板 中，待细胞融合80%，加入成骨诱导培养基，诱导21d后，行茜素红染色，并在倒置显微镜下 观察染色情况。
[0016] 成软骨诱导分化：取海绵或骨髓来源的第3代细胞，以105/孔的密度接种于6-fL 板中，待细胞融80%，加入成软骨诱导培养基，诱导21d后，行阿辛蓝染色，并在倒置显微镜 下观察染色情况。
[0017] 成脂诱导分化：取骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以105/孔的密度接种于 6-fL板中，待细胞融合90%，加入成脂诱导培养基，诱导21d后，油红0染色，并在倒置显微 镜下观察染色情况。
[0018] 5)统计学分析：实验数据均以均值土标准差表示。用SPSS17. 0软件分析，利用 单向方差分析（One-wayANOVA)法进行比较，计量资料采用t检验，计数资料的比较采用X2 检验。以P< 0. 05为差异有显著性意义，P< 0. 01差异有非常显著性意义。
[0019] 本发明提供的一种通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，其有益效果 是： 1)通过建立大鼠应力骨折模型，控制固定骨折处的力学环境，募集间充质干细胞，促进 骨折愈合，本方法操作简单，科学合理。
[0020] 2)验证了应力微动与细胞分子活动之间的关系，可用于研究骨折愈合早期应力 环境对骨折断端间充质干细胞募集的影响，以及用于间充质干细胞分化等指标的进一步研 究，指导确定骨折早期安全有效的康复方案，通过适宜应力募集更多间充质干细胞的同时， 关节功能恢复正常。
[0021] 3)采用剪切法分离骨折断端组织中的迁移细胞，简便易行，对细胞损伤很小，骨折 断端组织中的细胞大部分可以被分离出