具有杀菌活性的烟粉虱肽聚糖识别蛋白的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程技术领域。本发明涉及一种烟粉虱肽聚糖 识别蛋白（BtPGRP)基因及其所编码蛋白的应用，尤其涉及一种烟粉虱肽聚糖识别蛋白 (BtPGRP)的体外重组表达技术、活性重组蛋白的分离纯化以及对微生物的识别和杀菌抑菌 作用研究。
【背景技术】
[0002] 天然免疫反应是机体防御感染性疾病的一道重要防线，这一防御系统对于所有 多细胞生物生存和物种延续都是非常重要的。不同于哺乳动物，昆虫无免疫球蛋白，缺乏 获得性免疫，因此昆虫生存一大挑战就是识别外来病原物。在长期进化过程中发展出了 一套独特的病原物识别模式，可以识别病原物外壁脂多糖（LPS)、脂磷壁酸质类、脂蛋白、 肽聚糖（PGN)、0-1，3-葡聚糖并对其作出防御反应。这种病原微生物表面某些共有的高 度保守的分子结构称为病原相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpattern, PAMP)。免疫识别在进化过程中发展出多种能够识别一种或多种PAMP分子的模式识别受 体（patternrecognitionreceptor,PRP)，如清道夫受体（SCRs)、C-型凝集素（CTLs)、 革兰氏阴性菌结合蛋白GNBPs(Gram-negativebindingproteins)和肽聚糖识别蛋白 PGRPs(peptidoglycanrecognitionproteins)等。肤聚糖识别蛋白PGRPs是一类重要 的模式识别受体（PRR)，在识别病原体入侵和激活免疫调控途径中发挥着重要作用。肽聚 糖识别蛋白PGRP是在家蚕Bombyxmori中首次发现的，该蛋白能够结合肽聚糖，激活多酚 氧化酶级联反应。PGRP存在1个与17溶菌酶同源的结构域，并具有Zn依赖的N-乙酰胞 壁丙氨酸酰胺酶活性。目前在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster基因组中共发现了 13个PGRP基因编码17个PGRP蛋白、冈比亚按蚊Anophelesgambiae基因组中发现7个 PGRP基因，同源比对发现这些基因与哺乳动物PGRPs基因高度保守。目前研究发现PGRP在 昆虫先天免疫中可分为以下几类：a)识别病原体后诱发酚氧化酶原级联反应，产生黑色素 来包裹微生物；b)识别革兰氏阳性菌，激活Toll信号通路（PGRP-SA) ;c)识别革兰氏阴性 菌，激活Imd信号通路，诱导自我吞噬；d)酰胺酶活性，使PGN失活。此外，哺乳动物（人和 大鼠）中PGRP还具有抗细菌活性。最近研究发现昆虫中果蝇的PGRP-SB1、熊PGRP-S对芽 孢杆菌有抗菌作用。PGRP蛋白的杀菌机制有两种：一种是出于PGRP与肽聚糖不可逆的结 合，从而干扰细菌细胞壁的合成；另一种是一些PGRP具有酰胺酶活性。可以降解肽聚糖，从 而破坏细胞壁使菌体破裂，这种杀菌作用类似于青霉素。
[0003] 肽聚糖识别蛋白的结构和功能在昆虫和哺乳动物中已得到一定程度的研究， 但是，目前国内外尚没有烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP的研究报道。烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在世界各地暴发成灾，造成惨 重的损失。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传播多种植物病毒，是重要的 病毒传播媒介，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝收。PGRP在传毒媒介昆虫 烟粉虱中的研究，有利于更好的揭示其在免疫反应以及传播植物病毒中的作用及其工作机 制，同时也为开发广谱抗菌药物和筛选免疫增强剂提供依据。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，针对目前烟粉虱免疫反应研究状况及其不足，提供 一种具有杀菌活性的烟粉虱肽聚糖识别蛋白（BtPGRP)蛋白的制备及应用。
[0005] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：
[0006] 本发明提供了一种烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因，该基因的核苷酸序列如 SEQIDNO. 1 所示。
[0007] 本发明进一步提供了由烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因编码的蛋白，该蛋白的氨 基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0008] 本发明进一步提供了前述烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因在制备具有抗菌活性 的重组蛋白中的方法，是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有 抗菌活性的重组蛋白。
[0009] 本发明进一步提供了前述蛋白在制备抗菌类药物、食品保鲜剂或饲料添加剂中的 应用。
[0010] 本发明的有益效果在于：
[0011] 本发明所提供的烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因及其编码的核苷酸序列，使 其能够应用在大肠杆菌中表达新的蛋白、编码序列。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行 抑菌实验的结果表明：重组的烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因BtPGRP原核表达的重组蛋白具 有结合革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的能力，同时能够杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性 菌。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产，在开发广谱抗菌类药物和新 型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0012] 图1为IPTG诱导的pET28a-BtPGRP-BL21和纯化的重组烟粉虱肽聚糖识别蛋白 BtPGRP蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。1 :未诱导pET28a-BtPGRP-BL21 菌株；Lane2:ImM IPTG诱导的pET28a-BtPGRP-BL21菌株；3 :纯化重组蛋白；M:蛋白Marker。
[0013] 图2为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对大肠杆菌的识别作用图。
[0014] 图3为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对金黄色葡萄球菌的识别作 用图。
[0015] 图4为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对大肠杆菌E.coli的生长抑 制作用图。
[0016] 图5为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对金黄色葡萄球菌S.aureus 的生长抑制作用图。 具体实施方案
[0017] 本发明中，所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因cDNA的克隆方法是以烟粉虱总RNA反 转录得到cDNA为模板，构建cDNA文库，根据烟粉虱转录组筛选得到BtPGRP部分cDNA序 列，然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因 cDNA全长序列。
[0018] 本发明用于表达烟粉虱肽聚糖识别蛋白重组蛋白的成熟肽基因序列是以烟粉虱 肽聚糖识别蛋白全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到，它来源于烟粉虱肽聚糖 识别蛋白全长基因区域所对应的基因片段。
[0019] 本发明上述含有烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因的大肠杆菌基因表达载体优先由本 发明合成的烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因与大肠杆菌表达载体pET-28a构建的重组表达载 体,命名为pET28a-BtPGRP。
[0020] 本发明能表达烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因的大肠杆菌重组菌株优先由含有烟粉 虱肽聚糖识别蛋白的表达载体pET28a-BtPGRP转化大肠杆菌BL21 (DE3)而得到的菌株，命 名为pET28a-BtPGRP-BL21。
[0021] 上述烟粉虱肽聚糖识别蛋白的重组蛋白具体制备方法是通过如下技术方案来实 现：选取大肠杆菌重组菌株pET28a-BtPGRP-BL21接种在10ml含有卡那霉素的LB液体培养 基，37°C培养过夜，取50yl菌液加入到装有50mlKana+LB液体培养基的150ml无菌三角瓶 中，37°C，150rpm的摇箱中培养6?8h至对数期，加入lOOmMIPTG至终浓度为lmM，27°C， 250rpm振荡培养。当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组烟粉虱肽聚 糖识别蛋白。
[0022] 本发明所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP在制备具有活性的重组蛋白中应 用。其中，所述应用的方法是通过基因重组