一种乙酰胆碱受体介导靶向的d构型多肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属药学领域，涉及一种高度稳定且可介导靶向乙酰胆碱受体高表达细胞，并跨越相对应屏障膜(如血脑屏障)的D构型多肽及其纳米递药系统，具体涉及多肽dCDX(氨基酸序列为GdRdEdIdRdTGdRdAdEdRdWdSdEdKdF)及其修饰的高分子载体材料所构建的脂质体和聚合物胶束等纳米递药系统，以及体内外脑靶向性和在治疗脑部等疾病中的应用。
【背景技术】
[0002]脑部疾病是一类危害人类生命和健康的重大疾病。由于血脑屏障的存在，大约98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物包括蛋白和基因等难以入脑，严重影响了脑部疾病的治疗。本领域公知，血脑屏障(BBB)是一个由脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和紧密连接蛋白等共同构成的结构和功能屏障，它能够选择性地输送营养物质和必需的内源性物质入脑，并排出脑内毒性代谢物以及进入脑内的外源性物质，维持大脑内环境的稳定。血脑屏障也是阻碍药物进入脑部组织的主要障碍，然而脑毛细血管内皮细胞上存在多种特异性的受体，如转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体和乙酰胆碱受体等，以上述受体的配体或抗体作为靶向分子对纳米递药系统进行修饰或与药物形成复合物，通过受体介导的胞吞转运(receptor mediated transcytosis, RMT)将药物递送入脑是目前最成熟的脑靶向递药策略之一。因此，研究和开发可穿透血脑屏障的靶向分子，介导药物或递药系统穿透血脑屏障而实现药物的脑内传输，具有重要的现实意义。研究表明，肿瘤细胞也高表达各种相关受体，利用受体对应的配体作为靶向分子介导靶向递药是临床肿瘤治疗及诊断实践中最常用的策略。
[0003]烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是在脑组织包括组成血脑屏障的脑毛细血管内皮细胞、部分肿瘤细胞(如肺癌细胞)表达的一种门控型离子通道受体。本发明的申请人前期研究表明，一种起源于短神经毒素Candoxin的Loop II区域、氨基酸序列为FKESffREARGTRIERG的L构型多肽tDX，与nAChRs具有高亲和力，可携带递药系统穿透血脑屏障入脑。但因其稳定性较差，在血液中易被降解，降低了其体内脑靶向效果，而D构型多肽是解决其不足的最佳方案之一。多肽逆序合成被广泛用于设计与L构型多肽具有类似生物活性的高度稳定D构型多肽的制备方法。
[0004]针对上述问题，本申请的发明人拟提供一种D构型多肽靶向分子dCDX (氨基酸序列为GdRdEdIdRdTGdRdAdEdRdWdSdEdKdF),旨在提高靶向分子的稳定性，从而改善其所修饰的纳米递药系统跨越血脑屏障或靶向肿瘤细胞的能力，实现对脑部疾病和肿瘤靶向诊治的目标。
[0005]目前，未见可跨越血脑屏障的D构型多肽或dCDX修饰的纳米递药系统的研究报道。
[0006]多肽逆序合成法制备
【发明内容】
[0007]本发明的目的是制备一种具有高稳定性的D构型多肽靶向分子，并用其修饰高分子载体材料，构建包载药物的纳米递药系统，以提高对脑组织和肿瘤的靶向递药效果。
[0008]本发明采用多肽逆序合成技术，设计并制备了具有高稳定性并与烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)具有更高亲和力的D构型多肽D⑶X (氨基酸序列为GdRdEdIdRdTGdRdAdEdRdWdSdEdKdF) ο
[0009]本发明制备的dCDX在连接半胱氨酸后，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化的荧光物质反应形成复合物，所述的荧光物质选自FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR等。
[0010]本发明制备的D⑶X经上述巯基化后，可修饰在聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE )、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA )、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA),聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，用于构建1^DX修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统。
[0011]本发明中，dCDX修饰的纳米递药系统可包载紫杉醇、多烯紫杉醇，阿霉素、表阿霉素，喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春新碱，硼替唑米，DPM1-theta等抗肿瘤药物；也可包载治疗神经退行性疾病的药物，如银杏内酯、神经营养因子等药物；还可包载荧光物质，如FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR等。
[0012]本发明的dCDX可介导纳米递药系统靶向烟碱型乙酰胆碱受体高表达的细胞及其组织，可用于跨越血脑屏障递药治疗脑部疾病，或针对外周肿瘤的靶向诊治。
[0013]本发明提供了 dCDX制备方法和性质考察以及上述所修饰的纳米递药系统用于脑部疾病或肿瘤治疗的物质基础。
[0014]本发明尽进行了下述制备以及评价试验:
[0015]1.dCDX、11CDX-Cys 及其荧光标记物(DCDX_Fluorescein)的合成
[0016]根据逆序多肽合成技术，采用固相合成的方法制备D⑶X和D⑶X-Cys ;通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成DQ)X-Fluorescein。HPLC、MS表征结构。
[0017]2.Drax稳定性和受体亲和性评价
[0018]从血清稳定性、氨肽酶稳定性、与烟碱型乙酰胆碱受体蛋白结合能力和与高表达烟碱型乙酰胆碱受体的肿瘤细胞摄取能力等方面进行dCDX性质的考察，将dCDX、lCDX分别与大鼠血清和氨肽酶M在37°C进行孵育，在不同时间点检测dCDX、lCDX的浓度以进行稳定性的比较，采用放射竞争结合法评价dcdx、1CDX与烟碱型乙酰胆碱受体蛋白的结合能力，比较DQ)X-Fluorescein、LCDX-Fluorescein对烟碱型乙酰胆碱受体蛋白高表达的脑毛细血管内皮细胞(如:脑毛细血管内皮细胞bEnd.3)和模型肿瘤细胞(如:小细胞肺癌细胞NC1-H82)的体外靶向性，比较烟碱型乙酰胆碱受体蛋白高表达的血脑屏障模型对DCDX_Fluorescein、lCDX-FIuorescein 的转运能力。
[0019]3.1^DX修饰的纳米递药系统的构建与表征
[0020]( I) D⑶X-PEG-脂质体递药系统的构建与表征
[0021 ] 首先合成靶向分子修饰的高分子材料dcdx-peg-dspe和lcdx-peg-dspe。将11CDX-Cys 与 Mal-PEG-DSPE 在 pH7.2 的 PBS 和 DMF 的混合溶液中反应得到 dCDX-PEG_DSPE。将 LCDX-Cys 与 Mal-PEG-DSPE 按上述方法反应得到 LCDX_PEG_DSPE。
[0022]然后分别制备tDX、lCDX修饰的脂质体(1^DX-PEG-脂质体和YDX-PEG-脂质体)。以一定比例的 HSPC/Chol/mPEG2_-DSPE/DCDX-PEG-DSPE 或 LCDX-PEG_DSPE 为膜材料，采用成膜水化法制备dCDX-PEG-脂质体和lcdx-peg-脂质体，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，并分别包载DiR、FAM、阿霉素(DOX)，构建平均粒径在90nm的脂质体。动态光散射法测定粒径分布，负染色电镜法观察脂质体形态；
[0023](2) dCDX-PEG_DSPE胶束递药系统的构建与表征
[0024]以一定比例的mPEG2Q(l(|-DSPE/DCDX-PEG-DSPE为膜材料，分别以DiR和紫杉醇(PTX)为模型药物，采用成膜水化法制备dCDX-PEG-DSPE胶束，构建平均粒径为1nm的胶束；
[0025]4.dCDX-PEG-DSPE胶束递药系统的体内脑靶向性评价
[0026]对正常ICR 小鼠静脉注射 dCDX-PEG-DSPE 胶束 /DiR、LCDX_PEG_DSPE 胶束 /DiR 和PEG-DSPE胶束/DiR，比较不同递药系统的脑内分布；
[0027]5.1^DX-PEG-脂质体递药系统的体内外脑靶向性评价
[0028]考察bEncL 3 细胞对 dCDX-PEG-脂质体 /FAM、lCDX-PEG-脂质体 /FAM