一种制备高抗逆性酵母菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备高抗逆性酵母菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 由于传统化石能源用量急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加 快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点，其中，燃料乙醇的生产和应用在经济发展 和战略安全上显示出重大意义。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成 为我国能源政策的重要方向。纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发 酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油 资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和可持 续发展等方面具有积极作用。
[0003] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作为单细胞真核生物，具有易培养、生长 周期短的特点，已广泛应用于异源基因的表达。虽然普通酿酒酵母能够高效利用葡萄糖产 乙醇，但对发酵液中的抑制物和高浓乙醇耐受性（Almeida J R M et al.，2007)较差，特别 是对纤维素水解液中的抑制成分敏感，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌 株。其次，纤维素乙醇生产中，纤维素原料预处理过程产生和残留的降解物会对后续菌株发 酵造成不同程度的抑制，其中乙酸、糠醛、酚类和SO广等抑制因子对酵母有较强毒害作用， 会显著抑制细胞的生长及其发酵性能。
[0004] 目前，在纤维素乙醇生产菌种一酿酒酵母的研究领域，大多集中于将各种实验 室缺陷型菌种为研究对象进行改造，而缺乏能够应用于生产的野生型酵母模型，能够耐受 多重抑制物、具有高抗逆性的酿酒酵母具有更强的实用性，显然，研究能够在葡萄糖培养基 中培养的酵母菌株对筛选获得具有上述特性的酵母模型极为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有的酵母菌株抗逆性低的缺陷，提供一种制备高抗逆性酵 母菌株的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明提供一种制备在葡萄糖培养基中具有高抗逆性酵母菌 株的方法，其中，该方法包括：在葡萄糖培养基中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达量，所述葡萄糖培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。
[0007] 通过增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达量，酵母细 胞对抑制物的耐受性明显增强，因此，通过本发明的方法制得了具有较高抗逆性的酵母菌 株。
[0008] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【具体实施方式】
[0009] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0010] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语"抗逆性"是指微生物在偏离 其最佳生长条件下的环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的PH， 较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等环境。
[0011] 本发明提供的制备高抗逆性酵母菌株的方法，其特征在于，该方法包括：在葡萄糖 培养基中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达量，所述葡萄糖 培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。
[0012] mstngespapegagdsrdpsgfIseiigapvtvklnsgivykgdlqsvdgymnialerckevaegrvir nwgdafvrgnnvt yisadna(SEQ ID NO:1)
[0013] 本发明中，所述培养基可以为各种添加了葡萄糖的酵母培养基，优选情况下，所述 葡萄糖培养基含有5-100g/L (优选10-80g/L)的葡萄糖。
[0014] 所述葡萄糖培养基中，以乙酸根的含量计，含乙酸根离子源的含量优选为 0· 5-60g/L，更优选为 2-40g/L。
[0015] 本发明中，含乙酸根离子源可以为各种能够提供乙酸根离子的化合物，如水溶性 的乙酸和/或乙酸盐，优选为乙酸、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵中的至少一种。
[0016] 根据本发明的优选实施方式，所述葡萄糖培养基还可以含有氯化物（可以为氯化 钠、氯化钾和氯化铵中的至少一种）、硫酸盐（可以为硫酸钠和/或硫酸钾）、碳原子数为 2-8的醛（如糠醛）和碳原子数为6-16的酚（如苯酚）中的至少一种。更优选地，所述葡 萄糖培养基还含有25-95g/L(最优选为20-60g/L)的氯化物、0. 5-10g/L(最优选为4-6g/ U的硫酸盐、〇· 1-lg/L (最优选为0· 1-0. 5g/L)的碳原子数为2-8的醒和0· 1-lg/L (最优 选为0. 1-0. 5g/L)的碳原子数为6-16的酚中的至少一种。
[0017] 为了获得抗逆性更佳的酵母菌株，进一步优选地，所述葡萄糖培养基还含有l-6g/ L 的 Na2S04、20-60g/L 的 NaCl、10-30g/L 的 KC1、0. 1-0. 5g/L 的苯酚和 0· 1-0. 5g/L 的糠醛 中的至少一种。最优选地，所述葡萄糖培养基还含有4-6g/L的Na2S04、35-40g/L的NaCl、 20-30g/L的KCl中的至少一种（优选最多不超过两种）；或者，所述葡萄糖培养基还含有 0. 15-0. 3g/L的糠醛；或者，所述葡萄糖培养基还含有0. 2-0. 4g/L的苯酚。
[0018] 本发明中，所述葡萄糖培养基还可以含有5-20g/L的蛋白胨和2-8g/L的酵母抽提 物，以为菌株提供氮源和生长因子等。
[0019] 根据本发明的一种优选实施方式，本发明的葡萄糖培养基含有A组分和B组分， 其中，所述A组分为10-80g/L的葡萄糖和l-3g/L的乙酸，所述B组分为4-6g/L的Na 2S04、 35-40g/L 的 NaCl、20-30g/L 的 KCl、20-40g/L 的 NH4Ac、30-40g/L 的 NaAc 和 10-30g/L 的 KAc中的一种或两种。
[0020] 本发明中，可以通过本领域常用的各种方式增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达量。例如，可以将插入有表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示 的蛋白的核酸的表达载体转化到酵母细胞中，从而增加所述蛋白的表达量。因此，本发明对 所述酵母细胞没有特别的要求，只要能够表达氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白即可。 优选地，所述酵母细胞具有碱基序列如SEQ ID N0:2所示的核酸，S卩，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的编码核酸的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。此时，优选使用插入有碱基 序列如SEQ ID N0:2所示的核酸且具有强启动子的表达载体转化酵母细胞，以增加酵母细 胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达量。
[0021] gccaccatgtccggaaaagcttctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggt aagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgt tgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttt tgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO :2)
[0022] 其中，所述强启动子优选为PadhI启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。更优选地， 所述强启动子为Padhl启动子。
[0023] 其中，所述表达载体可以为插入有碱基序列如SEQ ID N0:2所示的核酸并能够使 该核酸表达的任何表达载体，例如，质粒或噬菌体。优选地，所述表达载体为在质粒PAUR123 的BamHl酶切位点和XhoI酶切位点之间插入碱基序列如SEQ ID NO:2所示的核酸而得到 的表达载体。
[0024] 其中，对所述表达载体中的终止子没有特别的限定，且本领域技术人员能够很容 易地选择适当的终止子来构建能够表达碱基序列如SEQ ID NO:2所示的核酸的表达载体。
[0025] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述酵母细胞具有碱基序列如SEQ ID NO:3 所示的核酸，即，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的编码核酸的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。此时，优选使用插入有碱基序列如SEQ ID N0:3所示的核酸且具有启动子的表 达载体转化酵母细胞，以增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达 量。
[0026] gccaccatgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggt aagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgt tgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttt tgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO :3)
[0027] 其中，所述启动子优选为Padhl启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。更优选地， 所述启动子为Padhl启动子。
[0028] 其中，所述表达载体可以为插入有碱基序列如SEQ ID N0:3所示的核酸并能够使 该核酸表达的任何表达载体，例如，质粒或噬菌体。优选地，所述表达载体为在质粒PAUR123 的BamHl酶切位点和XhoI酶切位点之间插入碱基序列如SEQ ID NO:3所示的核酸而得到 的表达载体。
[0029] 其中，对所述表达载体中的终止子没有特别的限定，且本领域技术人员能够很容 易地选择适当的终止子来构建能够表达碱基序列如SEQ ID NO:3所示的核酸的表达载体。
[0030] 本发明中，增加酵母细胞表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白的表达量的 方式可以为常规的培养酵母细胞的方式，优选包括在28-33°C下，在葡萄糖培养基中培养酵 母细胞24-72小时。
[0031] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中的实验和检测方法，如 无特殊说明，均为常规方法；所使用仪器，如无特殊说明，均为常规检测和操作仪器；所用 的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的；以下实施例中的定量试 验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中采用的培养基等如下：
[0032] 实施例中使用的酵母菌株-酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)RIPP_0 于2013年9月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101)，保藏编号为 CGMCC No. 8202。
[0033] YEro培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L。
[0034] 筛选培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，琼脂粉20g/L，乙酸 3g/L，胁迫因子（Na 2S04、NaCl、KC1、NH4Ac、NaAc 等）5-40g/L，自然 pH，倒平板备用。
[0035] 酸性种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，乙酸l_3g/L， pH5. 0〇
[003